冻干人用狂犬病疫苗及其制备方法技术

冻干人用狂犬病疫苗及其制备方法，涉及疫苗生产制备工艺领域，解决了现有只采用生物反应器生产狂犬疫苗存在的有效病毒抗原表达含量低、疫苗接种者副反应发生率高、疫苗产量和质量都达不到标准要求的问题。该疫苗是在Vero细胞上接种aG株狂犬病毒，依次经超滤浓缩、分离纯化、冻干后获得的；该疫苗的装量为0.5ml/剂；冻干时所用疫苗冻干保护剂的各成分及其终浓度为：海藻糖60～90g/l、谷氨酸钠6～14g/l、尿素3～6g/l、L-精氨酸2～3g/l、199培养基10g/l，该疫苗冻干保护剂中不含有明胶、人血白蛋白和右旋糖酐。本发明专利技术成本低、操作简单、不易污染，大幅度提高了疫苗的质量和产量，降低了疫苗内杂质的含量，不易发生过敏等反应，极大地提高了疫苗的安全性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于疫苗生产制备工艺
，具体涉及一种冻干人用狂犬病疫苗及其 制备方法。
技术介绍
狂犬病（Rabies)，是由狂犬病毒所致的自然疫源性或动物源性人畜共患急性传染 病，流行性广、病死率极高，对人民生命健康造成严重威胁。狂犬病的典型临床表现为恐水 症，故狂犬病又称恐水病。初期对声、光、风等刺激敏感而喉部有发紧感，进入兴奋期可表 现为极度恐怖、恐水、怕风、发作性咽肌痉挛、呼吸困难等，最后痉挛发作停止而出现各种瘫 痪，可迅速因呼吸和循环衰竭而死亡。狂犬病主要通过患病动物咬伤、抓伤或由粘膜感染引 起，在特定的条件下还可通过呼吸道气溶胶传染，受染动物唾液内含狂犬病毒，传染动物主 要是犬（超过90%)，其次是猫。 对犬进行严格管理、犬免疫或灭犬是控制人狂犬病的有效方法。目前对狂犬病尚 无特殊有效的治疗方法，病死率几乎100%。狂犬病疫苗是一个历史悠久的疫苗，接种狂犬 病疫苗后，人体血液中可出现抗狂犬病毒抗体，这些抗体可防止狂犬病毒在细胞间直接传 播，减少狂犬病毒的增殖量，同时还能清除游离的狂犬病毒，阻止狂犬病毒的繁殖和扩散， 从而达到预防狂犬病的目的。 目前狂犬病疫苗还存在着一些急需解决的问题。国内上市的狂犬病疫苗大多都含 有明胶和右旋糖酐，大多数对狂犬病疫苗的接种过敏反应是由疫苗中作为保护剂的明胶所 致，保护剂中的明胶成分也是疫苗内毒素的主要来源，可导致接种者产生发热反应，所以从 保护剂中去除明胶已经成为业界共识。同时，右旋糖酐本身也是一种强有力的抗原，它存在 于食糖中，并且在正常人的肠道里发现了可产生右旋糖酐的细菌。少部分人虽然从未接受 过右旋糖酐的治疗，而循环中却存在着多糖的沉淀素，这就是为什么首次用药就能出现变 态反应的原因。低分子右旋糖酐（如右旋糖酐40)过敏反应可在用药后半小时、几分钟甚 至几秒钟内发生，来势凶猛，抢救难度大，用药量几滴到几毫升即可发生过敏性休克反应， 甚至死亡。低分子右旋糖酐过敏反应的发生率为0. 03 %~4. 70 %，其过敏致死发生率较青 霉素高2~4倍。在因抢救无效死亡的右旋糖酐过敏病例中，因过敏性休克引起的死亡占 有相当大的比例。据国家药品不良反应监测中心发布的药品不良反应信息通报第3期中警 惕"右旋糖酐40与过敏性休克"显示：右旋糖酐40、低分子右旋糖酐引起的可疑不良反应主 要有皮瘆、肺水肿、肾功能衰竭、过敏性休克等，其中过敏性休克53例，死亡10例。可见右 旋糖酐的危险程度远远大于明胶，甚至接近于青霉素，已经上市的使用右旋糖酐作为保护 剂的狂犬病疫苗制品，不良反应率均有一定程度的升高。现有的狂犬病疫苗冻干制品或含 有明胶、或采用右旋糖酐替代了明胶，但至少含有上述两种成分中的一种。 近年来国内疫苗界普遍采用的细胞培养模式为"静止培养"和"转瓶培养"，缺点是 劳动强度和占地空间大，不利于疫苗产量和质量的提高。目前，出现了只单纯采用生物反应 器生产狂犬疫苗的方法，但是这种方法存在以下缺点：有效病毒抗原表达含量低、疫苗接种 者副反应发生率高、疫苗产量和质量都达不到标准要求。目前，利用细胞工厂培养特定的细 胞，再结合利用生物反应器接种特定的狂犬病毒株进行病毒连续培养和收获制备狂犬病疫 苗，还未见报道。
技术实现思路
为了解决现有只采用生物反应器生产狂犬疫苗存在的有效病毒抗原表达含量低、 疫苗接种者副反应发生率高、疫苗产量和质量都达不到标准要求的问题，本专利技术提供一种 。 本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下： 本专利技术提供的一种冻干人用狂犬病疫苗，该疫苗是在Vero细胞上接种aG株狂犬 病毒，依次经超滤浓缩、分离纯化、冻干后获得的；该疫苗的装量为0. 5ml/剂；冻干时所用 疫苗冻干保护剂的各成分及其终浓度为：海藻糖60~90g/l、谷氨酸钠6~14g/l、尿素3~ 6g/l、L-精氨酸2~3g/l、199培养基10g/l，该疫苗冻干保护剂中不含有明胶、人血白蛋白 和右旋糖酐。 本专利技术的冻干人用狂犬病疫苗中不含有任何抗生素及防腐剂。 本专利技术还提供了上述的冻干人用狂犬病疫苗的制备方法，该方法包括以下步骤： (1)毒种采用aG株狂犬病毒，培养基质采用Vero细胞； (2)将复苏后的Vero细胞采用0. 25 %胰蛋白酶消化分散均勾，加入199培养液混 合均匀后加入到细胞工厂中，置于37°C培养至均匀单层Vero细胞；所述细胞工厂采用美国 Nunc或CORNING公司生产的细胞工厂； (3)采用含10%新生牛血清的199培养液洗换生物反应器内的PBS溶液，生物反 应器参数设定：温度37°C，转速50rpm，PH7. 0,溶氧50 %，待各参数稳定后，接种已消化分散 均匀的单层Vero细胞，接种细胞数量即工作体积控制在2X IO5~5X 10 5个/ml范围内； 所述生物反应器采用美国NBS公司生产的14L固定床式BIOFLO CELLIGEN 310型生物反应 器； (4)根据Vero细胞的生长繁殖情况调整生物反应器的灌注量，当Vero细胞密度在 2 X IO7~4 X 10 7个/ml范围内时，接种aG株狂犬病毒； (5)弃去生物反应器内细胞培养8~10天的细胞生长液，加入病毒生长液即含 3%新生牛血清的199培养液，将工作种子批按0.025~0. 125M0I接种于生物反应器内，连 续灌注收获病毒液，生物反应器参数设定：温度35°C，转速90rpm，PH7. 5,溶氧50% ; (6)接种aG株狂犬病毒后第二天开始采用不含有任何血清成分的199维持液连续 收获病毒液，收获20天，取样做无菌检查及病毒滴定试验，置于2~8°C保存； (7)将同批细胞生产的多次病毒液在无菌条件下合并，采用300KD超滤膜浓缩，浓 缩后的病毒液中蛋白含量不超过20mg/ml，若超过该标准则需要进行稀释，再进行无菌检 查； (8)浓缩后的病毒液加入浓度为1:4000的β -丙内酯进行灭活，置于2~8°C连 续振摇24小时，2~8°C放置7天使残余的β -丙内酯水解，病毒液灭活后分别取样进行灭 活验证试验； (9)将灭活后的病毒液经4000rpm离心30分钟，吸取上清液，采用柱色谱法进行纯 化，色谱介质为琼脂糖凝胶S印harose 4FF，采用PH7. 4、浓度为0.0 lmol/L且含有0. 14mol/ L NaCl的PBS溶液洗脱，每次上样量不超过层析柱体积的5%，流速为100~170L/h，280nm 紫外监测收集第一峰，起峰后当紫外监测数值升到0.1 AU时开始收集，峰回落后当紫外监 测数值降至〇. IAU时结束收集，然后加入终浓度为1 %的人血白蛋白，即获得冻干人用狂犬 病疫苗原液，抽样做原液检定后，置于2~8°C保存； (10)冻干人用狂犬病疫苗原液经检定合格后，根据测定的原液抗原量和蛋白质 含量加入疫苗冻干保护剂进行稀释，成为疫苗半成品，然后采用低温真空冷冻干燥法进行 分装冻干：导热油温度设定KTC，保持KTC进行疫苗半成品分装，分装结束后，冷冻干燥箱 预冷冻至-45~-50°c，使制品温度达到-40°c以下保持至少2个小时，对后箱凝结器预冷 至-50°C后，开始抽真空，真空控制设定为8Pa±2Pa，真空报警为18Pa，真空抽至IOPa以下 进行第一阶段本文档来自技高网...

【技术保护点】
冻干人用狂犬病疫苗，其特征在于，该疫苗是在Vero细胞上接种aG株狂犬病毒，依次经超滤浓缩、分离纯化、冻干后获得的；该疫苗的装量为0.5ml/剂；冻干时所用疫苗冻干保护剂的各成分及其终浓度为：海藻糖60～90g/l、谷氨酸钠6～14g/l、尿素3～6g/l、L‑精氨酸2～3g/l、199培养基10g/l，该疫苗冻干保护剂中不含有明胶、人血白蛋白和右旋糖酐。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李锦宇，张欢，张晶，鞠长军，王群，孙婵，池凤臣，赵志平，于磊，张愉，莫飞，赵爽，孙婷婷，赵洪洋，张秋菊，
申请(专利权)人：长春长生生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22