一种对口蹄疫病毒有抑制作用的干扰靶序列制造技术

本发明专利技术公开一段对口蹄疫病毒有抑制作用的干扰靶序列。本发明专利技术的对口蹄疫病毒有抑制作用的干扰靶序列是位于奶牛功能基因ENTPDase6 mRNA上的RNA干扰靶序列，其序列为序列表中的SEQ ID No.1所示的核苷酸序列、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列和SEQ ID No.3所示的核苷酸序列所示的核苷酸序列。由上述的序列可分别确定出发夹状DNA互补序列，利用合适的基因载体将该DNA序列转染至牛细胞后可以转录成发夹状双链RNA，能够与奶牛功能基因ENTPDase6中的SEQ ID No.1片段特异性结合，从而抑制ENTPDase6的正常表达，使其表达产物量降低，进而抑制口蹄疫病毒的复制。

【技术实现步骤摘要】
一种对口蹄疫病毒有抑制作用的干扰靶序列
本专利技术涉及一段具有抑制免疫作用的序列，确切讲本专利技术涉及对口蹄疫病毒有抑制作用的干扰靶序列。
技术介绍
口蹄疫是一种由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)引起的，主要危害偶蹄兽的急性、热性和高度接触性人畜共患传染病。其特征是传播途径多，传播速度快，流行范围广，传染性强，感染率高，病原变异大，危害程度烈，几乎每年都给养殖业造成巨大的经济损失。交叉保护试验和血清学试验确证口蹄疫病毒有7个血清型，即O、A、C(欧洲型)和Asia1(亚洲1型)以及STA1、STA2、STA3(南非型)。目前还没有针对该病的有效治疗药物，主要还是以预防为主。然而实验证明，各不同血清型间几乎没有交互免疫性，即一种抗血清仅能保护一种病毒类型的感染。此外，口蹄疫发病迅速,传染极快，感染动物通常在2～3天内便发生严重的疾病。灭活疫苗一般在接种7天后才能产生保护性抗体，开始发挥抗病毒作用。因此，目前的疫苗不足以应对快速的疾病爆发，需要开发更有效的抗病毒策略来解决这些问题。
技术实现思路
本专利技术提供对口蹄疫病毒有抑制作用的干扰靶序列，以及由这些靶序列制备的质粒，预期这些干扰靶序列和质粒能够使奶牛对口蹄疫病毒有一定抑制作用，并可在培育转基因抗口蹄疫病毒奶牛中的应用。本专利技术的对口蹄疫病毒有抑制作用的干扰靶序列是位于奶牛功能基因ENTPDase6mRNA上的RNA干扰靶序列，其序列为序列表中的SEQIDNo.1所示的核苷酸序列、SEQIDNo.2所示的核苷酸序列和SEQIDNo.3所示的核苷酸序列所示的核苷酸序列。上述的序列SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3在培育转基因抗口蹄疫病毒奶牛中的应用。根据前述的SEQIDNo.1靶序列可确定出发夹状DNA互补序列，利用合适的基因载体将该DNA序列转染至牛细胞后可以转录成发夹状双链RNA，能够与奶牛功能基因ENTPDase6中的SEQIDNo.1片段特异性结合，从而抑制ENTPDase6的正常表达，使其表达产物量降低，进而抑制口蹄疫病毒的复制。该发夹状DNA互补序列的正义链序列为序列表中SEQIDNo.4；反义链序列为序列表中SEQIDNo.5。根据前述的SEQIDNo.2靶序列可确定出发夹状DNA互补序列，利用合适的基因载体将该DNA序列转染至牛细胞后可以转录成发夹状双链RNA，能够与奶牛功能基因ENTPDase6中的SEQIDNo.2片段特异性结合，从而抑制ENTPDase6的正常表达，使其表达产物量降低，进而抑制口蹄疫病毒的复制。该发夹状DNA互补序列的正义链序列为序列表中SEQIDNo.6；反义链序列为序列表中SEQIDNo.7。根据前述的SEQIDNo.3靶序列可确定出发夹状DNA互补序列，利用合适的基因载体将该DNA序列转染至牛细胞后可以转录成发夹状双链RNA，能够与奶牛功能基因ENTPDase6中的SEQIDNo.3片段特异性结合，从而抑制ENTPDase6的正常表达，使其表达产物量降低，进而抑制口蹄疫病毒的复制。该发夹状DNA互补序列的正义链序列为序列表中SEQIDNo.8；反义链序列为序列表中SEQIDNo.9。上述的各发夹状DNA互补序列可在培育转基因抗口蹄疫病毒奶牛中的应用。利用前述的发夹状DNA互补序列可以制备成相应的重组质粒。这些重组质粒也可在培育转基因抗口蹄疫病毒奶牛中的应用。众所周知，病毒的感染及致病性决定于病毒和机体两方面。病毒基因决定着病毒的侵入与复制能力；机体则通过主动或诱导产生的免疫物质发挥抗感染作用。因此，抗病毒感染研究也应从病毒基因和机体抗病毒基因两个方面进行研究。由于口蹄疫病毒存在多个血清型并且病毒本身容易容易变异，单纯用疫苗来预防口蹄疫的爆发难以达到理想的效果。而从动物机体本身入手，培育出具有抗病毒感染或复制的转基因动物是一个诱人的研究方向。转基因动物研究是人类按照意愿有目的、有计划、有根据、有预见地改变动物的遗传组成，是基于现代分子生物学和动物胚胎和配子生物工程技术的一项实验技术。转基因动物的产生标志着人们可成功应用转基因技术，避开物种间杂交不育的生殖隔离，进行基因交流，打破物种界限，突破亲缘关系的限制，培育出自然界和常规育种难以产生的具特别优良性状的动物品种。RNA干扰(RNAinterference)是一种有效的基因沉默技术，可通过沉默同源病毒基因或沉默与病毒复制有关的宿主基因，抑制病毒感染，且很少出现副作用，因此是一个强有力的潜在抗病毒武器。RNAi是一种序列特异性的转录后基因沉默过程，通过21-23bp的dsRNA分子引起与其同源性的mRNA序列的降解过程。在抗口蹄疫病毒研究方面，RNAi也起到了重要的作用，很多学者对此进行了大胆尝试。Chen等首次将RNAi技术运用到抗FMDV的研究当中，其设计的靶向FMDVVP1基因的siRNA，在BHK-21细胞中siRNA表达质粒可使FMDVVP1基因的表达降低80％～90％。接着又采用重组腺病毒载体表达siRNA，结果腺病毒能够完全抑制FMDV在细胞内的复制；在豚鼠试验中，腺病毒的抑制效应亦十分显著。随后又有许多不同国家的学者应用不同的载体对FMDV不同基因进行了干扰试验，都取得了一定的抗病毒效果。说明RNAi技术在抗口蹄疫病毒的研究中具有很大的潜力。然而这种干扰病毒基因的策略很容易受到病毒血清型及其易突变的影响。研究表明，FMDV主要以整联蛋白为受体，包括αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8四种整联蛋白和硫酸乙酰肝素，其中αv是四种整联蛋白的共同亚基。因此可利用基因敲除技术将奶牛体内编码整联蛋白的基因敲除掉活着沉默掉，然后利用胚胎干细胞克隆技术培育出整联蛋白基因缺失的奶牛胚胎干细胞，进而培育出对口蹄疫病毒具有一定抗性的奶牛。此种抗病奶牛对口蹄疫病毒不存在血清型的差异，具有普遍的抗性，因此具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。然而对于单纯依靠沉默病毒受体基因进行抗病育种来说并还未见有取得突破性的进展相关的报道。可能是由于受体基因本身对于动物机体的组成成分、新陈代谢及其它生理功能有重要的作用。在动物机体内寻找与病毒的感染、复制、组装及释放相关的基因对抗病育种极其重要，可以通过沉默或修饰这些基因来达到抗病育种的目的。最近研究表明，破坏掉ENTPDse6基因可以一定程度上抑制口蹄疫病毒在牛细胞内的复制。ENTPDse6，即CD39L2，属于胞外核苷三磷酸-二磷酸水解酶家族，是一种完整的可以水解膜外核苷酸的等离子膜蛋白，已经证实在心脏、脑、肺脏、肝脏、骨骼肌及内皮组织中都有表达。ENTPDse6可以影响宿主蛋白糖基化必须的核苷数量，而这些宿主蛋白对于FMDV的复制或其它基本产生步骤是必需的。故可以考虑对此基因进行沉默改造，对抗口蹄疫育种来说无疑是种新的路径。本专利技术的专利技术思路为：RNA干扰通过21-23bp的dsRNA分子引起与其同源的mRNA序列的降解，是一种序列特异的转录后基因沉默过程。由于哺乳动物细胞最有效的siRNA是21-23个碱基大小、3′端有两个突出碱基的双链RNA。siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默效果，并且受GC含量、自身稳定性及其他本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对口蹄疫病毒有抑制作用的干扰序列，其特征在于其序列如SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种对口蹄疫病毒有抑制作用的干扰靶序列组，其特征在于，所述干扰靶序列组为SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3。2.一种针对权利要求1所述的干扰靶序列组确定的发夹状DNA组，其特征在于：所述发夹状DNA组的正义链序列为SEQIDNo.4、SEQIDNo.6和SEQIDNo.8；其反义链序列为序列表中SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：张永光，王永录，刘永生，陈豪泰，张杰，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62