本发明专利技术提供一种表达重组抗体的CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法,所述方法包括如下步骤:1)通过细胞诱导凋亡剂处理表达重组抗体的CHO细胞系,得到诱导凋亡后的CHO细胞系;2)然后通过胞内流式细胞术分析所述诱导凋亡后的CHO细胞系;3)根据胞内流式细胞术分析的结果,计算平均荧光强度和荧光强度分布峰型图,通过荧光强度分布峰型图和CHO细胞系的产量的相关性,及所述峰型图确定CHO细胞系的稳定性。本发明专利技术的方法,相比传统的细胞系稳定性鉴定方法,流式法则能在早期判定细胞系的稳定性,无需再进行产量评估,可以节省较多的时间、人力和实验试剂耗材的消耗。此外,该方法还具有高通量的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞生物学领域,涉及一种细胞系的鉴定方法,尤其涉及一种表达重 组抗体CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法。
技术介绍
流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒 子进行定量分析和分选的检测手段,它可以高速分析数万个细胞,并能同时从一个细胞中 测得多个参数,与传统的荧光镜检查相比,具有速度快、精度高、准确性好等优点,成为当代 最先进的细胞定量分析技术。自70年代以来,随着流式细胞技术水平的不断提高,其应用 范围也日益广泛。流式细胞术已普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传 学、生物化学等临床医学和基础医学研宄领域(参见:杜立颖,冯仁青.《流式细胞术》北京 大学出版社.2008)。 细胞凋亡最早由Kerr在1972年根据细胞的形态学特征提出(Kerr JF,Wyllie AH, Currie AR.Apoptosis: a basis biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer, 1972, 26:239-257)。细胞凋亡是细胞对 内外信息刺激的应答反应,且为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡,是 一种生理性死亡(Physiogical cell death,PO))(参见:张晓军,姚天明,王文亮·细胞 凋亡的最新研宄进展.第四军医大学学报,2002, 23:42-44)。 基因重组工程细胞系已充分应用于重组蛋白体外表达领域。如重组人促红素蛋白 (EPO),重组人胰岛素(insulin),以及各类单克隆抗体药物的生产等。重组EPO和重组人胰 岛素均为原核表达,主要宿主细胞为大肠杆菌,该表达系统具有快速,高产的特点,但因为 是原核细胞,生产的蛋白可能形成包涵体,需要复性,并且没有糖基化修饰,同时内毒素也 是主要污染源。目前,已知的各类抗体药物,包括治疗乳腺癌的赫赛汀(Herceptin),治疗淋 巴瘤的美罗华(Rituxan)和治疗结肠癌的爱必妥(Erbitux)等,都是在CHO细胞体系中表 达CHO细胞为中国仓鼠卵巢细胞,属于哺乳动物细胞,其中表达的蛋白具有正确的折叠和 糖基化修饰,同时也避免了内毒素污染。 但是,使用CHO细胞体系表达重组抗体,首先需要建立稳定细胞系。稳定细胞系 可在长期连续传代过程中,稳定地表达重组蛋白,在传代60-80次之后,重组蛋白的表达水 平不低于原代表达水平的70%。为鉴定建立的细胞系稳定性,传统的方法是将细胞系进行 60-80次连续传代,并在传代过程进行不同代次细胞的产量评估,然后将不同代次细胞的产 量与原代细胞的产量进行比较。CHO细胞的传代一般2-3天为一代,经过60次传代则需要 至少120天。可以看到,传统的细胞系稳定性鉴定方法非常耗时耗力,导致做稳定性鉴定的 细胞系不会太多,并且在传代过程中极易因人为因素造成结果的偏差。 因此,专利技术设计一种能够快速鉴定CHO细胞系早期稳定性的方法成为必要。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前传统的细胞稳定性评价时间长,导致做稳定性鉴定的细 胞系不会太多,并且在传代过程中极易因人为因素造成结果的偏差的不足,提供一种表达 重组抗体CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法,从而能在早期(15代以前)判定CHO细胞系 的稳定性,无需再进行产量评估,可以节省较多的时间、人力和实验试剂耗材的消耗。此外, 该方法还具有高通量的特点,可以同时对几十甚至上百个克隆进行鉴定,确定表达量和稳 定性的高低。 除非特别指明,本文中的"早期"是指"细胞系从原始细胞库复苏后,每三天传代一 次,每次以一比六传代,连续传代不超过15代的时间段"。 除非特别指明,本文的一些术语和缩略语的含义如下: CHO :中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary) FCM :流式细胞术(Flow Cytometry) FITC :异硫氛酸焚光素 (Fluorescein Isothiocyanate) APC :别藻青蛋白(Allophycocyanin) PE :藻红蛋白(P-phycoerythrin) MFI :平均焚光强度(Median Fluorescence Intensity) VCD :活细胞密度(Viable Cell Density) ROS :活性氧族(Reactive Oxygen Species) RA :全反式维甲酸(Retinoic Acid) PBS :磷酸盐缓冲液 FBS :胎牛血清(Fetal Calf Serum) MTX :甲氨蝶呤(Methotrexate) ATP :腺卩票呤核苷三磷酸(Adenosine triphosphate) PKC :蛋白激酶 C(Protein kinase C) PKA :蛋白激酶 A(Protein kinase A) AD :防线菌素 D (Actinomycin D) GFX :Bisindolylmaleimide I(GF-109203X) ROT :咖马林(Rottlerin) OA :同田酸(Okadaic acid) CAF :咖啡因(Caffeine) PCD :生理性死亡(Physiogical cell death) IGF-1 :膜岛素样生长因子-I (Insulin-like growth factor I) MPK :丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases) MNP :细胞线粒体的膜电位(Mitochondrial membrane potential)。 针对上述目的,本专利技术提供的技术方案如下: 本专利技术提供一种表达重组抗体的CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法,所述方法包 括如下步骤: 1)通过细胞诱导凋亡剂处理表达重组抗体的CHO细胞系,得到诱导凋亡后的CHO 细胞系; 2)然后通过胞内流式细胞术分析所述诱导凋亡后的CHO细胞系; 3)根据胞内流式细胞术分析的结果,计算平均荧光强度和荧光强度分布峰型图, 通过荧光强度分布峰型图和CHO细胞系的产量的相关性及所述峰型图,确定CHO细胞系的 稳定性;其中,荧光强度分布峰型图以荧光强度为横坐标,以细胞计数为纵坐标制图。 优选地,在步骤3)中,所述平均荧光强度通过对荧光强度分布峰型图积分得到, 所述产量与平均荧光强度呈正相关。 优选地,所述确定CHO细胞系的稳定性包括以下步骤: A)分析同一克隆不同代次之间胞内平均荧光强度和克隆产量的相关性;和/或分 析不同的克隆的胞内平均荧光强度和克隆的相对产量的高与低,来确定CHO细胞系的稳定 性峰型图; B)通过步骤A)中分析同一克隆或不同克隆的荧光强度分布峰型图为单峰、双峰 来确定CHO细胞系的稳定性,稳定CHO细胞系在峰型图中以单峰形式出现,不稳定CHO细胞 系在峰型图中以双峰或多峰形式出现。 优选地,所述步骤2)通过包括以下步骤的方法进行: (1)通过固定剂处理所述诱导凋亡后的CHO细胞系,得到固定后的CHO细胞系; (2)然后通过破膜剂处理所述固定后的CHO细胞系,得到破膜后的CHO细胞系; (3)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达重组抗体的CHO细胞系稳定性的早期鉴定方法,所述方法包括如下步骤:1)通过细胞诱导凋亡剂处理表达重组抗体的CHO细胞系,得到诱导凋亡后的CHO细胞系;2)然后通过胞内流式细胞术分析所述诱导凋亡后的CHO细胞系;3)根据胞内流式细胞术分析的结果,计算平均荧光强度和荧光强度分布峰型图,通过荧光强度分布峰型图和CHO细胞系的产量的相关性,及所述峰型图确定CHO细胞系的稳定性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员:胡伶俐,周祥,王瑞,张敬,范克索,周鹏飞,
申请(专利权)人:武汉友芝友生物制药有限公司,
类型:发明
国别省市:湖北;42
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