本发明专利技术公开了一种均相酶解纤维素的方法，以分子量为20000单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺为修饰剂，定点修饰市售纤维素酶的巯基，制得修饰纤维素酶，标记为Cell-Mal 20k；用合成的修饰酶Cell-Mal 20k在氢氧化钠/尿素水溶液中均相酶解纤维素，反应温度30℃，反应时间1h,体系pH值13.98，反应结束后，冷却至-10℃，Cell-Mal 20k与产物相分层，分别回收Cell-Mal 20k和产物相，Cell-Mal 20k无需处理，可直接循环使用。本发明专利技术的特点在于所制备的修饰纤维素酶稳定性高且具有温敏性，在强碱性的氢氧化钠/尿素水溶液中仍能保持高的活性和温控性，实现了酶的高效回收和重复使用，为纤维素提供了一条高效酶解的新途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种在NaOH/尿素/纤维素均相体系下，聚乙二醇马来酰亚胺修饰纤 维素酶均相酶解纤维素及其温控分离的方法。
技术介绍
纤维素是全球再生量最大的生物质资源，每年生物合成量超过500亿吨。纤维素 高值化利用的关键在于如何使其高效降解成单糖，进而可以转化成用途广泛的重要化学品 或燃料。因此从长远考虑，实现纤维素高效转化成单糖是解决化石资源日益减少所带来的 全球资源危机的有效途径之一。 目前纤维素降解方法包括物理法、化学法和生物法，其中生物法是指利用纤维素 酶对纤维素中0 -糖苷键进行特异性水解，从而制得糖类化合物的一种有效方法，具有对 环境友好，能耗低，副产物少等优点，被认为是最具应用前景的转化途径。但是，由于纤维 素是线性长链高分子聚合物，其分子中的羟基易和分子内或相邻分子上的含氧基团形成强 氢键作用，使纤维素分子共同组成结晶结构，该结构使纤维素显示出刚性和高度水不溶性， 大大减弱了纤维素酶对纤维素的可及性，导致纤维素的转化率低，酶解周期长，成本高。因 此，需要寻找对纤维素有高效溶解能力的溶剂，以瓦解纤维素的这种高度结晶结构，有利于 纤维素酶与纤维素的有效接触，促进其酶解。目前，对纤维素具有良好溶解能力的溶剂有 N-甲基吗啉-N-氧化物（NMM0)、氯化锂/二甲基乙酰胺（LiCl/DMAc)体系、氨基甲酸酯体 系和离子液体等，这些溶剂在不同程度上存在着价格高、溶解条件苛刻、易挥发、回收困难、 所得溶液粘稠等问题，极大地限制了纤维素的应用。2005年武汉大学的张俐娜老师开发了 新一类溶解纤维素的溶剂体系，NaOH/尿素、NaOH/硫脲、LiOH/尿素水溶液体系，其中NaOH/ 尿素体系以其廉价和高效的溶解性能成为大家关注的热点。采用7wt%NaOH/12wt%尿素 水溶液预冷至-12°C，它能迅速溶解纤维素（重均分子量Mw为1. 2X105)得到透明的溶液 (5min内完全溶解）。该纤维素溶液在0~5°C的范围内能够长时间保持稳定的溶液态（约 1周）。这种新溶剂体系采用了最经济、最普通的化工原料，且所用的化学原料容易回收， 可循环使用，因此该体系被认定是新一代无污染的绿色纤维素新溶剂。在该体系下，溶剂 小分子更易与纤维素上的-0H基团结合形成新的氢键网络从而破坏纤维素原有的分子内 和分子间氢键，使得纤维素在小分子溶剂的包合下，以链状形式均匀分布于水中，得到透明 的纤维素溶液。若能在该体系下实现均相酶解，同时反应后将纤维素酶分离出来，进行循环 利用，那么富含还原糖的NaOH/尿素体系就可通过pH的调节以适应后期发酵生产。可以设 想，按照以上的研宄思路，一个高效绿色的纤维素利用体系将被建立。
技术实现思路
本专利技术的目的是创制具有高效高稳温敏的纤维素酶，以实现在NaOH/尿素体系下 纤维素的均相酶解及纤维素酶的有效回收。 本专利技术的技术方案是这样实现的：将7wt%NaOH/12wt%尿素水溶液预冷 至-12°C，然后加入微晶纤维素，得到均相溶液，pH值为13. 98,纤维素占溶剂的重量比 5-10%。在30°C下加入修饰纤维素酶，加入量为每毫升溶剂0. 5_5mg，反应1小时，纤维素 转化成还原糖的转化率在70-80%。反应结束后，体系降温到-10°C，修饰酶主动从反应体 系中析出，可直接回收利用。 本专利技术采用的修饰纤维素酶是这样得到的：在30-35°C下，在柠檬酸-磷酸氢二钠 缓冲溶液（pH= 7.0)中，加入天然纤维素酶，待其完全溶解后，缓慢加入等质量的分子量 20000聚乙二醇马来酰亚胺，混合均匀后，恒温反应3小时，停止反应，通过透析纯化得到修 饰纤维素酶，标记为Cell-Mal20k。 本专利技术采用的纤维素酶，酶活力：180〇11/毫克，最佳口11:4.8，最佳温度50°〇。 本专利技术采用微晶纤维素原料的分子量2. 5~5万，聚合度153~300,灰分 < 0? 6%，粒径 25 ~190ym。 专利技术效果 本专利技术提供的新型修饰纤维素酶，能在强碱性NaOH/尿素体系下表现出良好的活 性和稳定性及温敏性，很好地促进纤维素降解，并可高效回收纤维素酶。使用本专利技术的方法 可提高天然纤维素酶抵制环境引起酶失活的能力，从而提高了酶的催化活性，在反应过程 中始终保持较高的催化活性，并可实现酶的高效回收和重复使用，具有明显的先进性，将为 纤维素资源的综合利用提供一条新的途径。【具体实施方式】 以下结合实施例进一步说明，并非限制本专利技术所涉及的范围。 实施例1 : 微晶纤维素原料：分子量2. 5~5万，聚合度153~300,灰分< 0. 6%，粒径25~ 190um〇 还原糖量的测定方法 DNS试剂：1. 6gDNS和21gNaOH，加入到200mL水中溶解，185g酒石酸钾钠溶于 500mL水中，与上溶液混合加入5g结晶酚，5g无水亚硫酸钠搅拌溶解，冷却定容于1000mL 容量瓶，储于棕色瓶中7-10天后使用。 葡萄糖标准曲线：将葡萄糖在105°C下烘干2h至恒重，精确称取0.lg用蒸馏水 溶解，并定容到l〇〇mL此浓度为1. 0mg/mL。取10支20mL的具塞刻度试管，依次加入OmL、 0. 2mL、0. 4mL、0. 6mL、0. 8mL、1.OmL、1. 2mL、1. 4mL、1. 6mL、1. 8mL葡萄糖标准溶液，然后每支 试管中加入蒸馏水，总体积为2.OmL，再分别加入0. 5mLDNS试剂，摇均后在沸水中准确放 置5min，取出用流水迅速冷却，用蒸馏水定容至20mL，充分摇均后静置20min。最后在波长 540nm处测各比色管中溶液的吸光值A，以吸光值作纵坐标，相应葡萄糖浓度C(mg/mL)作横 坐标，得到葡萄糖标准曲线。 在装有温度计、冷凝管和转子的50mL三口瓶中加入15mLpH= 7. 00. 1M的现配柠 檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；设定水浴加热温度为35°C，待瓶内温度稳定后加入150mg纤 维素酶粉末，缓慢搅拌溶解；称取150mg分子量20000的单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺作为 修饰剂，并开始计时，混合均勾；反应3h后，反应液通过透析袋（截留20k大分子）在pH= 4. 80. 1M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中透析过夜；得到纯化修饰纤维素酶液，冻干得到修 饰纤维素酶粉。记作Cell-Mal20k，4°C下保存。 称取7. 5g7wt%NaOH/12wt%尿素水溶液于100mL三口瓶中，降温到-12°C，加入 375mg微晶纤维素（5 %w/w)溶解5分钟，得到均相溶液，体系pH值13. 98。在此均相溶液 中加入15.Omg的Cell-Mal20k，30°C下反应1小时后，取0. 5mL反应酶液，加入1. 5mLDNS 试剂，沸水终止反应显色5min，冰水冷却至室温，蒸馏水定容至20mL。在540nm下测定吸光 度值，代入标准葡萄糖曲线，得到还原糖量达到4. 25mg/mL，纤维素转化为还原糖的转化率 为70%。反应结束后，体系降温到-10°C，修饰酶自动从体系中析出，经离心后回收，无需任 何处理，直接回用。 实施例2 :微晶纤维素原料：分子量2. 5~5万，聚合度153~300,灰分< 0. 6%，粒径25~ 190um〇 还原糖量的测定方法和修本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种均相酶解纤维素的方法，其特征在于以分子量为20000单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺为修饰剂，定点修饰市售纤维素酶的巯基，制得修饰纤维素酶，标记为Cell‑Mal 20k；用合成的修饰酶Cell‑Mal 20k在氢氧化钠/尿素水溶液中均相酶解纤维素，反应温度30℃，反应时间1h,体系pH值13.98，反应结束后，冷却至‑10℃，Cell‑Mal 20k与产物相分层，分别回收Cell‑Mal 20k和产物相，Cell‑Mal 20k无需处理，可直接循环使用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李露，于世涛，刘仕伟，刘福胜，解从霞，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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