一株检测汞的大肠埃希氏菌制造技术

本发明专利技术提供一种检测重金属汞的大肠杆菌工程菌株的构建方法及其检测水体中汞方法的建立。本发明专利技术所述基因工程菌株为merR：：PmerT：：cfp-linker-cfp/E.coliΔzntA，命名为E.coli WMC-010(CGMCC No.9749)，其中来源于粘质沙雷氏菌的met操纵子敲入野生型E.coli MC4100菌株基因组的zntA位置，启动表达青色荧光蛋白CFP。本发明专利技术所述工程菌株能够克服含报告质粒的报告菌株具有荧光本底值高、独立实验重复性欠佳和难以精确定量水体中重金属汞的缺陷，并且能够反映水体中汞的生物有效性，从而为客观评价水体中汞的生物毒性效应提供依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测汞的微生物学方法，具体涉及利用基因工程技术改造的大肠 埃希氏菌的构建方法及建立其在检测水体环境中汞的方法，属于环境生物

技术介绍
汞，俗称水银，汞是环境中毒性最强的重金属元素之一，易挥发，在常温、常压下呈 液态，易流动，是唯一以气态单质形式存在于环境中并参与全球循环的重金属元素。汞对 人体的危害程度与汞的化学形态有关，其中有机汞化合物，尤其是甲基汞毒性最高、危害最 大。典型的汞污染事件是发生在日本熊本县的"水俣病"事件。水俣病的起因是由于汞是 一种不能被分解或降解成无害物质的元素，一旦被排放到环境中后，便会在其中持久存在， 并以不同形态循环于空气、水、土壤和生物圈之间。沉降后的汞会通过微生物的各种复杂的 转化作用转变成毒性更强的甲基汞，从而进入食物链。通过生物积累和生物放大作用，从食 物链低端到高端，生物体内汞浓度逐渐得到富集，当人们摄入汞含量水平较高的鱼类或者 贝类时，各种形态的汞尤其是甲基化的汞会在人体内积累，从而危害大脑皮质，导致患者手 足协调失常，甚至步行困难、运动障碍、弱智、听力及言语障碍、肢端麻木、感觉障碍、视野缩 小；重者例如神经错乱、思觉失调、痉挛，最后死亡。发病起三个月内约有半数重症者死亡， 怀孕妇女亦会将这种汞中毒带给胎中幼儿，令幼儿天生弱智。 汞的化合物溶解度很小，除Hg(N03) 2，外这种性质直接影响它在环境中的赋存形态 和迀移性及其迀移转化规律。汞的天然来源为含汞原矿。在风化作用下，汞以固体微粒等 形态进入环境中。进入土壤中的汞可以被植物吸收，也可以挥发进入大气，还可以被降水冲 进入地面水和地下水中。大气中气态和颗粒态的汞随风飘散又可沉降到地面或水体中。由 于特殊的物理化学性质和强的毒性，汞已经成为全球关注的污染物。汞的排放来自于自然 源和人为源两个部分，自然源包括：火山活动、自然风化、土壤排放和植被释放等，人为源排 放指的是因人类活动引起的汞排放，包括汞的使用、物质当中含有汞杂质以及废物处理引 起的汞排放三大类。我国是需汞大国，是仅次于西班牙和意大利的第三产汞国，人为排放是 汞污染的主要原因。它们通过排放废水、废渣、废气等方式将汞及其化合物排放到自然环境 中，造成周边地区空气、水体、土壤、植物等的污染，再通过多种途径进入人体，对人体的各 个系统造成了严重的危害。国家规定的废水环境中汞的排放标准<0.05mg/L，因此，检测水 环境中汞离子的排放对环境保护是一项重要任务。 目前监测和检测重金属污染物主要有两种方法：（1)物理化学分析法，如电感耦 合等离子体原子发射光谱（ICP-AES)、电感耦合等离子体质谱（ICP-MS)等，其优点是具备 高检测灵敏度和高特异性，但也存在一些不足，如仪器设备昂贵，操作复杂，检测周期长，最 重要的一点是，传统的物理化学方法主要是对环境重金属总量进行测定，不能检测重金属 的生物可利用度；（2)微生物法，微生物法一般分为基质粒整合型和基因组整合型。质粒整 合型具有成本低、检测周期短、易操作、特异性强的优点，但是因为质粒拷贝数高以其在传 代过程中易消失，导致检测本底值高和检测信号不稳定的缺点。在文献Developmentofa broad-spectrumfluorescentheavymetalbacterialbiosensor,AparnaChaudhariet al，2012，MolBiolR印，2012Dec;39(12):11225-9。中将检测元件整合到质粒中，特异性 差，Zn2+、Cd2+和Hg2+都能诱导此菌株产生荧光，且诱导时间在16h以上，耗时长。 微生物法原理是利用模式生物中存在的反应元件与汞化合物的分子反应机理，汞 检测元件是此汞检测菌株的核心。汞检测元件必备的三个组成元件分别为：针对特定物质 (汞）的特异感应器、由感应器调控的启动子和受启动子控制的报告基因，这三种元件组成 的融合报告基因反应水环境中汞离子的变化情况。在众多微生物模式生物中，细菌具有生 长快速、在环境中大量存在和成本低的优点，尤其大肠埃希氏菌是微生物传感器研宄的普 遍研宄的模式生物。汞离子在大多数革兰氏阴性菌种的转运和调节机制都已经比较清楚， 但是在大肠埃希氏菌中还没有找到相应的反应元件基因，因此，需要用基因融合技术将异 源型的特异调苄基因和启动子与报告基因拼接在大肠埃希氏菌基因组中，并确保异源型汞 检测元件在大肠埃希氏菌中能够正常表达。 细菌中采的调控元件为mer操纵子一般存在于Tn21和Tn501两种转座子中。当 环境中不存在汞离子时，调节蛋白merR充当阻遏蛋白，与启动子结合，阻碍了RNA聚合酶与 启动子结合，无法启动下游转运基因marT和merP的表达，当环境中存在采离子时，采离子 与调节蛋白merR，调节蛋白merR与RNA聚合酶脱离，RNA聚合酶能够与启动子结合，启动 下游基因表达；当环境中没有汞离子时，RNA聚合酶与merR结合，无法与启动子结合启动下 游基因转录表达。我们尝试将异源的调节蛋白基因、启动子和报告基因融合在一起组成一 个汞检测元件，再整合到大肠埃希氏菌基因组中。荧光蛋白基因是常用的报告基因，此发 明我们将用荧光蛋白作为报告基因用来替换mer操纵子中启动子下游基因，所以当环境中 的汞离子与调苄基因结合后，启动子启动下游荧光蛋白基因的表达，从而通过荧光蛋白荧 光强度反应汞离子浓度。为了提高大肠埃希氏菌对汞离子的敏感性，我们尝试将两个相同 的焚光蛋白拼接起来，组成一个具有双焚光蛋白的采检测元件，文献Versatilebiosensor vectorsfordetectionandquantify-icationofmercury,LarsHestbjergHansen,et al，FEMSMicrobiolLett，2000Dec1;193(1) :123-7。中只连接一个荧光蛋白基因gfp，荧 光强度不高，检测信号不强。 本专利技术所述大肠埃希氏菌生物检测菌株可以克服质粒整合型本底高并且不稳定 的缺点，构建一种特异、敏感和快速检测汞的大肠埃希氏菌菌株，为检测水体中汞离子奠定 基础。此整合后的大肠埃希氏菌应用在水环境中汞离子的浓度检测，将造福于人类致力于 除污减排的这一大课题中。
技术实现思路
本专利技术的目的：一、采用基因工程技术构建一株荧光本底值低、稳定及定量检测水 体中重金属汞浓度及其生物有效性的大肠埃希氏菌生物检测菌株；二、建立一种水体中重 金属汞的微生物学检测方法。
技术实现思路
之一：提供一株检测水体中重金属汞的大肠埃希氏菌生物检测菌株， 本专利技术的大肠埃希氏菌（Escherichiacoli)WMC_010,已于2014年9月29日在中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西 路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，邮编100101)保藏，分类命名为大肠埃希氏菌 (Escherichiacoli)，保藏编号为CGMCCNo. 9749。 本专利技术将两个青色荧光蛋白连在汞检测元件中，相对于单个荧光蛋白荧光信号更 强。 汞检测融合报告基因含有三个组成元件：调苄基因merR、汞特异性启动子PmerT 以及荧光报告基因。当环境中不存在汞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株大肠埃希氏菌(Escherichia coli)WMC‑010，保藏号为CGMCC No.9749。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吕建新，肖芳兰，王伍，吴文鹤，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33