一种pH释放型免疫传感器的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种pH释放型免疫传感器的制备方法及应用，属于新型生物传感检测技术。具体是把氧化还原探针硫堇封装在介孔二氧化硅-Au的介孔内，得到检测抗体标记物—介孔二氧化硅-Au，制备一种检测肿瘤标志物的夹心型电化学免疫传感器。为检测肿瘤标志物开辟了新的检测方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。具体是将氧化还原探针硫堇封装在介孔二氧化娃-Au中，利用硫堇的氧化还原特性来对肿瘤标志物进行检测，制备一种检测肿瘤标志物的释放型免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测

技术介绍
目前电化学免疫传感器已经广泛应用于肿瘤标志物的检测，释放型免疫传感器是一种比较新颖的检测肿瘤标志物的方法，因此受到更加广泛的关注。近年来，介孔硅材料由于其具有较大的比表面积，较高的孔容和可调节的孔径，受到了吸附、传感等领域的广泛关注。因此，利用其具有良好的吸附性能来对硫堇进行吸附，并用羧基功能化金Au-COOH对其孔道进行封闭，使得硫堇稳定在介孔二氧化硅的孔道内，介孔二氧化硅-Au作为传感器制作中的检测抗体标记物，制得检测肿瘤标志物的免疫传感器，利用PH控制孔道的开和关，来达到检测的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是制备一种pH释放型免疫传感器。本专利技术的目的之二是将该pH释放型免疫传感器应用于肿瘤标志物的检测。本专利技术的技术方案 1.一种pH释放型免疫传感器的制备方法 (1)依次用1.0,0.3,0.05 Mm的三氧化二铝抛光粉对磁电极进行抛光处理，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2-0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV ； (2)取6μ?,Ο.5-3 mg/mL的氨基化四氧化三铁溶液滴加到电极表面，室温下晾干； (3)滴加3PL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液与N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液的混合液到电极表面，再继续滴加6 μ?、5~10 Pg/mL的肿瘤标志物捕获抗体，4°C下晾干，超纯水冲洗； 所述1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液与N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液的浓度均为0.1 mol/L，其体积比为1~4:1; (4)用3PL、质量分数为0.5-1%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，4°C下晾干，超纯水冲洗； (5)将6μ?的一系列不同浓度的肿瘤标志物溶液滴加到电极表面，用于和抗体的特异性识别，室温下孵化I h，超纯水冲洗； (6)继续滴加4~6μ?检测抗体孵化物一介孔二氧化硅-Au-Ab2溶液至电极表面，置于4°C冰箱中孵化I h，清洗后，晾干，制得一种pH释放型免疫传感器； 2.检测抗体孵化物一介孔二氧化硅-Au-Ab2溶液的制备 (1)介孔二氧化硅的制备 将0.3?0.7 g的CTAB溶于200 mL的超纯水中，加入1~2 mL、2.0 mol/L的NaOH，于80°C回流反应20 min，随后加入1.5~3.0 mL的四乙氧基硅烷，继续反应2 h生成白色沉淀，为了去除溶液中残留的CTAB，得到的沉淀重新分散在1.5 mL、质量分数为37%的HCl和75~100mL的甲醇的混合液中，80°C下回流10~12 h，将混合物离心，经水和甲醇洗涤数次，35~45°C下真空干燥，制得介孔二氧化硅，粒径大小为100 nm左右，孔径大小为5 nm左右； (2)缩醛链接器修饰的介孔二氧化硅MSN-Aetal的制备 将0.1-0.3 g的介孔二氧化硅分散于20 mL乙醇中，加入0.2~1 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，80°C回流反应12 h，混合物经离心、洗涤、45°C下真空干燥，得到氨基化的介孔二氧化硅； 将0.1~0.3 g氨基化的介孔二氧化硅加到10 mL的二甲基亚砜溶液中，随后加入50-100 mg 丁二酸酐和50~100 mg三乙胺，40°C下反应48 h，得到的固体经乙醇洗涤，真空干燥得到羧基化的介孔二氧化硅； 分别将20~80 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和10~30 mg的N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶于3 mL超纯水中，加入50-100 mg羧基化的介孔二氧化硅，80-130 mg的3，9-双(3-氨丙基)-2，4，8，10-四氧杂螺 ^^一烷，室温下搅拌8 h，沉淀经洗涤干燥得到缩醛链接器修饰的介孔二氧化硅MSN-Aetal ; (3)羧基功能化金Au-COOH的制备 将20 mL、1%的HAuCljP 0.5 mmol巯基琥?白酸分散于85 mL的去氧甲醇中，在搅拌下，将25 mL、0.2 mol/L的NaBH4S液滴加到上述溶液中，得到的深棕色沉淀经乙醇洗涤后，真空干燥，制得羧基功能化金Au-COOH ； (4)检测抗体标记物一介孔二氧化硅-Au的制备 将10~20 mg的缩醛链接器修饰的介孔二氧化硅MSN-Aetal加入到0.5~3mmol/L、lmL的硫堇水溶液中，室温下搅拌12 h，加入4~10 mg的羧基功能化金Au_C00H、10 mg的1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和5 mg的N-羟基琥珀酰亚胺NHS，继续搅拌8 h，混合物经离心洗涤直到上清液为无色后，将沉淀重新分散在I mL的超纯水中，成功的将硫堇封装在介孔二氧化娃-Au中，制得检测抗体标记物介孔二氧化娃-Au ； (5)检测抗体孵化物一介孔二氧化硅-Au-Ab2溶液的制备 将I mL的检测抗体标记物介孔二氧化娃-Au与I mL、10 μ g/mL的检测抗体溶液混合后，在4°C的条件下孵化12 h，离心后，将沉淀重新分散在I mL、pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，保存在40C的冰箱中备用。3.肿瘤标志物的检测方法 (I)将权利要求1所制备的免疫传感器浸泡在0.5 mL、pH=3.7的醋酸盐缓冲溶液12h ； (2 )采用三电极体系，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极，导电玻璃作为工作电极，采用微分脉冲伏安法对上述浸泡液进行扫描测试，将电压设置为-0.4-0.6 V，记录电流的变化，绘制工作曲线； (3)将待测样品溶液代替肿瘤标志物抗原标准溶液进行测试。上述肿瘤标志物选自下列之一:CD146、AFP、CA153、CA125。本专利技术的有益成果 (I)基底采用的是具有磁性的氨基化四氧化三铁，可以很稳定的吸附在磁电极上，并且其具有良好的生物相容性和稳定性。(2)介孔二氧化硅具有大的比表面积、良好的吸附能力和生物相容性，有利于将大量的硫堇封装在介孔二氧化硅-Au中，防止了硫堇的泄露，利用调节pH来对孔道的开关进行控制，提高了传感器的灵敏度。(3)本专利技术制备的电化学免疫传感器用于肿瘤标志物的检测，响应时间短，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测。【具体实施方式】实施例1一种pH释放型免疫传感器的制备方法 (1)依次用1.0,0.3,0.05 Mm的三氧化二铝抛光粉对磁电极进行抛光处理，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2-0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV ； (2)取6μ?、0.5 mg/mL的氨基化四氧化三铁溶液滴加到电极表面，室温下晾干； (3)滴加3μ?的1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液与N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液的混合液到电极表面，再继续滴加6 μ?、5 Pg/mL的肿瘤标志物捕获抗体，4°C下晾干，超纯水冲洗； 所述1-(3- 二甲氨基丙基)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种pH释放型免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）依次用1.0、0.3、0.05 µm的三氧化二铝抛光粉对磁电极进行抛光处理，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在‑0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV；（2）取6 µL、0.5~3 mg/mL的氨基化四氧化三铁溶液滴加到电极表面，室温下晾干；（3）滴加3 µL的1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液与N‑羟基琥珀酰亚胺NHS溶液的混合液到电极表面，再继续滴加6 µL、5~10 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体，4℃下晾干，超纯水冲洗；所述1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液与N‑羟基琥珀酰亚胺NHS溶液的浓度均为0.1 mol/L，其体积比为1~4 : 1；（4）用3 µL、质量分数为0.5~1%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，4℃下晾干，超纯水冲洗；（5）将6 µL的一系列不同浓度的肿瘤标志物溶液滴加到电极表面，用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，超纯水冲洗；（6）继续滴加4~6 µL检测抗体孵化物—介孔二氧化硅‑Au‑Ab2溶液至电极表面，置于4℃冰箱中孵化1 h，清洗后，晾干，制得一种pH释放型免疫传感器。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李娜，魏琴，马洪敏，王超，刘振，闫涛，吴丹，庞雪辉，李贺，胡丽华，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37