本发明专利技术涉及用于识别相对于其野生型具有提高的特定代谢物细胞内浓度的细胞的方法，其中通过重组工程实现细胞的修饰，以及用于制备相对于其野生型具有优化的特定代谢物产量的经基因修饰的生产细胞的方法，用于制备这些代谢物的方法，以及适合于此的核酸。根据本发明专利技术，编码重组酶的基因，其与已知的重组酶同源，经由载体转化到细胞中，并且将包含至少一个经修饰的基因G1‑Gn或至少一个突变的DNA引入到该细胞中，并借助代谢物传感器识别具有最高代谢物产量的细胞。由这些细胞中分离出对升高的产量负责的突变，提取这些基因或突变并引入到生产菌株中，其由此表现出升高的代谢物产量。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】用于识别相对于其野生型具有提高的特定代谢物细胞内浓 度的细胞的方法，其中通过重组工程实现细胞的改变，以及 用于制备相对于其野生型具有优化的特定代谢物产量的经 基因修饰的生产细胞的方法，用于制备这种代谢物的方法， 以及适合于此的核酸 本专利技术涉及用于识别相对于其野生型具有提高的特定代谢物细胞内浓度的细胞 的方法，其中通过重组工程实现细胞的改变，以及用于制备相对于其野生型具有优化的特 定代谢物产量的经基因修饰的生产细胞的方法，用于制备这种代谢物的方法，以及适合于 此的核酸。 几十年来，微生物在工业上被用于生产低分子量分子。低分子量分子是例如 天然细菌代谢物如氨基酸（EP1070132Bl，WO2008/006680A8)、核苷和核苷酸（EP 2097512Cl，CA2297613Cl)、脂肪酸（TO2009/071878Cl，TO2011/064393Cl)、维生 素（EP0668359Cl)、有机酸（EP0450491Bl，EP0366922BI)或糖（EP0861902C1， US3642575A)。通过细菌生产的低分子量分子也是通过例如源自植物的异源基因的表 达形成的那些分子。它们是植物活性物质。实例包括紫杉醇（W0 1996/032490Cl，WO 1993/021338Cl)、青蒿素（W0 2009/088404Cl)和属于类异戊二烯、苯丙素类或生物碱 类类别的另外的分子（MarienhagenJ，BottM，2012，JBiotechnol.，doi.org/10. 1016/ j.jbiotec. 2012. 06. 001)。通常，除植物来源的分子或分子的前体而外也可用微生物 制得这些具有经济利益的分子。这些包括例如用于制备甲基丙烯酸酯的羟基异丁酸 (PCT/EP2007/055394)、用于制备塑料的二胺（JP2009-284905A)或用作燃料的醇（W0 2011/069105C2,WO2008/137406Cl)。 适合用作生产低分子量分子的微生物是革兰氏阴性的细菌、革兰氏阳性的细 菌和酵母菌。合适的细菌例如是属于肠杆菌属（GenusEnterobacteria)的埃希氏杆 菌各种（Escherichiaspecies)如大肠杆菌，或属于厚壁菌属（GenusFirmicutes)的 芽抱杆菌各种（Bacillusspecies)如枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis)，或属于厚 壁菌属的乳球菌各种（Lactococcusspecies)如乳酸乳球菌（LactococcusIactis)或 乳杆菌各种（Lactobacillusspecies)如干酷乳杆菌（Lactobacilluscasei)，或属于 子囊菌属（GenusAscomycetes)的酵母属各种（Saccharomycesspecies)如酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)，或耶氏酵母属各种（Yarrowiaspecies)如解脂耶氏酵母 (Yarrowialipolytica)，或属于棒状杆菌属（GenusCorynebacterium)的棒状杆菌属各种 (Corynebacteriumspecies)。 棒状杆菌中优选的是有效棒状杆菌（Corynebacteriumefficiens) (DSM44549)、 热产氨棒状杆菌（Corynebacteriumthermoaminogenes)(FERMBP-1539)和产氨棒 状杆菌（Corynebacteriumammoniagenes) (ATCC6871)，但特别是谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacteriumglutamicum) (ATCC13032)。谷氨酸棒状杆菌的一些种是根据现有技术 下的其它名称已知的。例如嗜乙酰乙酸棒状杆菌（Corynebacteriumacetoacidophilum) ATCC13870、百合棒状杆菌（Corynebacteriumlilium)DSM20137、栖糖蜜棒状杆菌(Corynebacteriummelassecola)ATCC17965、黄色短杆菌（BrevibacteriumfIavum) ATCC14067、乳酸发酵短杆菌（Brevibacteriumlactofermentum)ATCC13869、散枝短杆菌 (扩展短杆菌）ATCC14020 和嗜氨微杆菌（Microbacteriumammoniaphilum)ATCC15354〇 为了形成和生产低分子量分子，表达或增强表达该低分子量分子的合成途径的微 生物本身的基因、或同源基因或异源基因，或提高其mRNA的稳定性。为此，这些基因可以在 质粒或载体上引入到细胞中，或它们可以存在于附加体上，或整合到染色体中。细胞自身的 染色体编码的基因也可以在它们的表达中得以增加。这例如通过染色体中适当的突变在启 动子区域中实现。也可以将导致产量增加的其它突变引入到染色体中，所述其它突变例如 影响mRNA的稳定性，或渗透稳定性，对pH值变化的耐受性，或者也可将其功能未知、但对 产物的形成有有利影响的基因引入到染色体中。同源基因或异源基因也被嵌入到染色体 中，或者它们被如此嵌入，以至于它们在染色体中以多次复制存在。 有针对性地将突变或基因嵌入到基因组中需要构建质粒，该质粒通过利用限制性 核酸内切酶和DNA连接酶在体外重组DNA序列来制备。为有针对性地引入染色体突变， 整个过程还包括以下步骤：为实现体内置换，对成功置换的测试，和最后对增加的产物形 成的测试。这需要在图1 (左）中示意性列出的多个步骤，Al-A8。这种方法适用于许 多用于生产小分子的细菌。实例是谷氨酸棒状杆菌（Smallmobilizablemulti-purpose cloningvectorsderivedfromtheEscherichiacoliplasmidspK18andpK19: selectionofdefineddeletionsinthechromosomeofCorynebacteriumglutamicum. SchaferA，TauchA，JagerW?KalinowskiJ?ThierbachG?PlihlerA.Gene. 1994 Jul22; 145(1) :69-73)，或绿胺杆菌（Pseudomonasaeruginosa)(Allelicexchangein PseudomonasaeruginosausingnovelColEl-typevectorsandafamilyofcassettes containingaportableoriTandthecounter-selectableBacillussubtilissacB marker.SchweizerHP.MolMicrobiol. 1992May;6(9):1195_204)，或枯草芽抱杆菌 (Bacillussubtilis)(Constructionofamodularplasmidfamilyforchromosomal integrationinBacillussubtilis.GimpelM，BrantlS.JMicrobiol.Method本文档来自技高网...
【技术保护点】
相对于其野生型经基因修饰的细胞，其包含编码未存在于野生型中的重组酶的基因序列并额外包含编码代谢物传感器的基因序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：S宾德，L埃格林，M博特，
申请(专利权)人：于利奇研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE
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