高分辨率解链的改进校准制造技术

本发明专利技术涉及用于在高分辨率解链PCR实验中进行温度校准的方法和试剂盒。本发明专利技术进一步涉及用于最优校准的方法，其允许靶物和校准物的相同或相似解链温度的读出。本发明专利技术进一步涉及用于实施所述方法的仪器和执行所述方法的计算机程序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高分辨率解链的改进校准专利技术背景本专利技术涉及用于在高分辨率解链PCR实验中进行温度校准的方法或试剂盒。本说明书进一步涉及用于最优校准的方法，其允许靶物和校准物的相同或相似解链温度的读出。本说明书进一步涉及用于实施所述方法的仪器和执行所述方法的计算机程序。高分辨率解链(highresolutionmelting,HRM)是一种在PCR扩增后检测靶序列中未知核酸变异的方法。与传统方法例如变性梯度凝胶电泳(DGGE)相比，HRM提供用于突变扫描的几个优势。这些优势包括较低的试剂和样品消耗，较少的优化步骤以及在单次实时定量PCR中可执行的封闭测试形式。在能够非共价结合双链核酸的特殊荧光DNA结合染料(例如480Resolight染料，RocheAppliedScience，目录号04909640001)的存在下，对长达约250个碱基对的靶序列PCR扩增后，加入生成的扩增子的HRM步骤。因为所述荧光非共价双链DNA结合染料不抑制PCR，所以其可以以饱和浓度加到扩增反应中。在HRM步骤中，所述荧光非共价双链DNA结合染料被释放，且可以检测到野生型、纯合子和杂合子突变体之间关于扩增子解链图谱的差异(ReedGH,KentJO,WittwerCT(2007),Pharmacogenomics8(6):597-608；WittwerCT(2009),Hum.Mutat.30(6):857-859；Wittwer等，美国专利号7,582,429)。根据点突变的类型，观察到的解链温度差异可能非常小。单核苷酸多态性(SNPs)通常导致解链温度在约1.0℃(对于1类SNPs(C/T和G/A碱基改变)和2类SNP(C/A和G/T碱基改变))、约0.5℃(对于3类SNPs(C/G碱基改变))和约0.2℃(对于4类SNPs(A/T碱基改变)为约0.2℃)之间的变化。与野生型相比，杂合子突变通常表现出不同的荧光解链图谱(解链曲线形状)，而纯合子突变通常导致与野生型非常相似的解链图谱，且仅能通过较小的温度变化区分。关于HRM的现有技术展现出如本文下面所述的几个缺点。为了检测解链温度中的小差异，要求测量系统极高的温度精度。实时PCR仪器通常设计为基于模块的系统，其使用Peltier元件进行精确温度控制。然而，所述温度控制受制于物理限制，其由例如温度传感器的校准、Peltier元件的控制以及微孔板个体和加热模块底座的几何契合所导致。这些限制通常导致在加热模块中最热和最冷位置之间观察到的0.5-1.0℃的温度范围。因此，反应体积中的温度控制不允许在纯合突变体与其野生型相比具有非常相似的特征性解链图谱(profile)的HRM实验中区分较小的温度变化。为了修正在基于模块的热循环仪的所有位置处不均匀的温度分布，目前建立了两种不同的方法：在于特定的仪器上实施HRM实验之前，使用特殊的校准板来执行分开的温度校准运行。将所有位置的所述模块特异性温度数据保存于所述仪器的软件中，并随后用于HRM实验来修正所有位置的温度差异。这种方法建立用于例如AppliedBiosystems7500和7900HT实时PCR系统(例如HRMCalibrationPlate，目录号PN4425618)和BioradCFX实时PCR系统(例如MeltCalibrationKit，目录号184-5020)。所述校准方法的缺点在于，当实施分开的温度校准运行时，温度不均一的实验特异性原因无法被修正。这些包括微孔板个体在加热模块底座中的不同契合，以及从底座到板和反应体积的温度传递中相关的差异。此外，例如由不同的离子强度(由纯化方法或样品材料导致的)导致的不同反应条件影响观察到的解链温度。另外，Peltier模块的热老化不能通过此方法补偿。1)在HRM试验中，内部的温度校准物被加到每一个反应中。所述温度校准物由未标记的双链寡核苷酸组成，其采用低于或高于所述靶序列的预期解链温度的解链温度，并使用在反应中存在的荧光非共价双链DNA结合染料来检测。基于测量到的孔与孔之间校准物的温度差异，修正检测到的目标温度。这一方法建立用于例如IdahoTechnology的仪器(HighSensitivityMasterMix，目录号HRLS-ASY-0008)。温度校准物方法的缺点：对未标记的内部温度校准物的检测基于用于靶突变检测的相同荧光非共价双链DNA结合染料的释放。因此所述目标解链温度必须与校准物解链不重叠。这将扩增子的大小限制到约40-120个碱基对的范围。此外，根据靶物的G/C含量，所述扩增子长度必须优化到适合于允许的解链温度范围。另外，所述扩增子解链的荧光亮度必须不能胜过并因此遮盖内部校准物信号。荧光亮度强烈依赖于产生的PCR产物的量。因此，在执行HRM实验之前，对于每一个靶物，开始核酸材料的量和引物的浓度必须优化。本说明书的目的是提供用于HRM的方法，其不显示上述缺点。专利技术概要本说明书的第一个方面涉及用于PCR实验中温度校准的方法，其中所述方法包括以下步骤a)在多孔板的每个孔中提供用于扩增样品中的特定靶核酸的反应混合物，其包含荧光非共价双链DNA结合染料，b)在每个孔中提供双链寡核苷酸，其中供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链，其中接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第二条链，c)在每一个孔中扩增所述特定靶核酸，d)在每个孔中解链所述特定靶核酸从而导致自所述荧光非共价双链DNA结合染料的放射发射的减少，以及解链所述双链寡核苷酸从而导致自所述供体生色团的放射发射的增加或自所述接受体生色团的放射发射的减少，其通过供体生色团和接受体生色团的空间分离进行，e)通过检测自所述荧光非共价双链DNA结合染料的放射发射的减少，在每个孔中监控所述扩增的特定靶核酸的解链温度值，并分开地通过检测自所述供体生色团的放射发射的增加或自所述接受体生色团的放射发射的减少，在每个孔中监控所述双链寡核苷酸的解链温度，f)基于所述双链寡核苷酸解链温度值的孔与孔差异，对于每个孔修正所述扩增的特定靶核酸的解链温度值。本说明书的第二个方面涉及用于实施在上述PCR实验中的温度校准的试剂盒，其中所述试剂盒包含a)用于在样品中扩增特定靶核酸序列所有的必要试剂，b)荧光非共价双链DNA结合染料，c)双链寡核苷酸，其中供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链，其中接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第二条链。本说明书的第三个方面涉及用于实施在上述PCR实验中的温度校准的反应混合物，其中所述反应混合物包含a)靶核酸序列，b)用于扩增特定靶核酸序列的所有的必要试剂，c)荧光非共价双链DNA结合染料，以及d)双链寡核苷酸，其中供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链，接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第二条链。本说明书的第四个方面涉及用于在上述PCR实验中实行温度校准的仪器。本说明书的第五个方面涉及用于执行在上述PCR实验中温度校准的方法的计算机程序。附图说明图1：本图显示了实施例1中32种野生型、32种杂合突变体和32种纯合突变体在不使用校准物时的标准化解链曲线。所述实验在带有热学未校准的PCR模块的仪器上进行。图2：本图显示了实施例1中32种野生型、32种杂合突变体和32种纯合突变体在使用校准物时的标准化解本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于在PCR实验中温度校准的方法，其中所述方法包括以下步骤：a)在多孔板的每个孔中提供用于扩增样品中的特定靶核酸的反应混合物，其包含荧光非共价双链DNA结合染料，b)在每个孔中提供双链寡核苷酸，其中供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链，且其中接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第二条链，c)在每一个孔中扩增所述特定靶核酸，d)在每个孔中解链扩增的特定靶核酸从而导致自所述荧光非共价双链DNA结合染料的放射发射减少，以及解链所述双链寡核苷酸从而导致自供体生色团的放射发射增加或自接受体生色团的放射发射减少，其通过空间分离供体生色团和受体生色团实现，e)通过检测自所述荧光非共价双链DNA结合染料的放射发射的减少在每个孔中监控所述扩增的特定靶核酸的解链温度值，并且分开地通过检测自所述供体生色团的放射发射的增加或自所述接受体生色团的放射发射的减少在每个孔中监控所述双链寡核苷酸的解链温度值，f)基于所述双链寡核苷酸的解链温度值的孔与孔差异，对每个孔修正所述扩增的特定靶核酸的解链温度值。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.01.10 EP 13150790.71.用于在PCR实验中温度校准的方法，其中所述方法包括以下步骤：a)在多孔板的每个孔中提供用于扩增样品中的特定靶核酸的反应混合物，其包含荧光非共价双链DNA结合染料，b)在每个孔中提供双链寡核苷酸，其中供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链，且其中接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第二条链，c)在每一个孔中扩增所述特定靶核酸，d)在每个孔中解链扩增的特定靶核酸从而导致自所述荧光非共价双链DNA结合染料的放射发射减少，以及解链所述双链寡核苷酸从而导致自供体生色团的放射发射增加或自接受体生色团的放射发射减少，其通过空间分离供体生色团和受体生色团实现，e)通过检测自所述荧光非共价双链DNA结合染料的放射发射的减少在每个孔中监控所述扩增的特定靶核酸的解链温度值，并且分开地通过检测自所述供体生色团的放射发射的增加或自所述接受体生色团的放射发射的减少在每个孔中监控所述双链寡核苷酸的解链温度值，f)基于所述双链寡核苷酸的解链温度值的孔与孔差异，对每个孔修正所述扩增的特定靶核酸的解链温度值；其中所述荧光非共价双链DNA结合染料的放射波长和所述供体生色团的放射波长彼此分开。2.权利要求1的方法，其中所述特定靶核酸包含单核苷酸多态性。3.权利要求1或2的方法，其中所述供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第一条链中的核苷酸，所述接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸第二条链中的核苷酸，其中第一条链中的所述核苷酸和第二条链中的所述核苷酸形成互补碱基对。4.权利要求3的方法，其中所述供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链的5’端，且所述接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第二条链的3’端，或者其中所述供体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第一条链的3’端，且所述接受体生色团共价结合所述双链寡核苷酸的第二条链的5’端。5.权利要求1-2和4中任一项的方法，其中所述荧光非共价双链DNA结合染料是480Resolight染料。6.权利要求3的方法，其中其中所述荧光非共价双链DNA结合染料是480Resolight染料。7.权利要求1-2、4和6中任一项的方法，其中所述供体生色团是Cy5。8.权利要求3的方法，其中所述供体生色团是Cy5。9.权利要求5的方法，其中所述供体生色团是Cy5。10.权利要求1-2、4、6和...

【专利技术属性】
技术研发人员：A赖泽，G萨格纳，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH