本发明专利技术涉及一种具有除磷功能的恶臭假单胞菌P.PAO-1及驯化培养方法，所述恶臭假单胞菌pseudomonas P.PAO-1的保藏编号为：CGMCC No.8073，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。培养：将恶臭假单胞菌P.PAO-1的菌种接种于5-10ml灭菌富集培养基预培养，然后再接种于100-200ml灭菌富集培养基内，在30℃条件下，震荡培养12-24h，清洗，离心，重悬浮形成菌液；然后再进行厌氧、好氧交替培养驯化，得到驯化菌。本发明专利技术通过富集-驯化二阶段培养模式培养，在P.PAO-1菌株体内形成聚羟基丁酸的初始积累，并应用于低浓度含碳有机废水处理中，实现高效除磷的目的。
【技术实现步骤摘要】
一种具有除磷功能的恶臭假单胞菌P.PAO-1及驯化培养方法
本专利技术属于除磷功能菌及其驯化培养方法领域，特别涉及一种具有除磷功能的恶臭假单胞菌P.PAO-1及驯化培养方法。
技术介绍
近年来，我国的水体富营养化日趋严重；研究表明，大量的城市污水处理厂污水中磷的超标排放是引发水体富营养化的重要原因[1]。我国现阶段污水处理厂采用的脱氮除磷生物处理工艺中，活性污泥的生物除磷的能力低是亟待解决的重要问题。聚磷菌(PAOs)是生物除磷法的主要完成者，它可在厌氧条件下分解胞内聚磷、糖原释放能量，并利用这些能量吸收废水中的有机碳源，在体内合成聚羟基烷酸(PHA)。在好氧条件下，PAOs氧化贮存在体内的PHA同时释放能量，PAOs利用这部分能量吸收远远超过其生理需要的磷，在其体内合成多聚磷酸盐(poly-p)及其糖原等其它多聚物。聚磷菌具有超量吸磷潜能核心环节是在体内形成并积累大量的PHA(其中主要成分是聚羟基丁酸，PHB)。研究发现，PHB是微生物体内碳源与能源的高分子储存物，积累PHB的细菌，对逆境的抵抗力增强，在不利生长条件下的存活率较高[2,3]。因此，高效诱导聚磷菌利用有限的碳源在短时间内在菌体中形成与积累PHB，是保证聚磷菌在后续阶段高效吸磷的关键。作为细菌细胞的必要组分，磷元素在菌体内的含量约为2％[4]。目前，所报道分离纯化出的具有除磷功能的菌株，其除磷途径主要通过菌体在好氧条件下吸收磷酸盐并转化为细菌细胞基本组成，也即通过菌体大量增殖实现废水除磷目标。然而，菌体大量增殖过程长需要伴有高浓度的碳源与较长时间的微生物/废水接触时间，这在实际废水处理工程中难以实现，因此，也限制了实验室培养的聚磷菌在低有机浓度废水除磷中的应用。但若改变传统的培养模式，采取富集-驯化二阶段培养模式培养菌株，即第一阶段采用富集培养，在高碳源、营养均衡条件下扩增菌量，第二阶段采用营养失衡条件对菌体进行驯化培养，会诱导菌体内预先合成与积累PHB[5]，而菌体内大量的PHB预贮备会对潜在的除磷菌株的除磷能力产生较大的影响。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种具有除磷功能的恶臭假单胞菌P.PAO-1及驯化培养方法，本专利技术所提供的恶臭假单胞菌P.PAO-1通过富集-驯化二阶段培养模式培养，在菌体内形成PHB的初始积累，并将其应用于普通的低浓度含碳有机废水处理中，实现高效除磷的目的。本专利技术的一种具有除磷功能的恶臭假单胞菌P.PAO-1，所述恶臭假单胞菌(pseudomonassp.)P.PAO-1的保藏编号为：CGMCCNo.8073，其16SrRNA序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的一种具有除磷功能的恶臭假单胞菌P.PAO-1的驯化培养方法，包括：(1)将恶臭假单胞菌P.PAO-1的菌种接种于5-10ml灭菌富集培养基预培养，然后再接种于100-200ml灭菌富集培养基内，在30℃条件下，震荡培养12-24h，清洗，离心，重悬浮形成菌液，菌液OD为1.0-1.3；(2)将菌液转移至装有100-200ml灭菌富碳限氮驯化培养基A的容器中，控制菌液细菌细胞浓度约为1.5g干细胞/L，通入氮气5-30min赶尽容器内空气，并将其置于30℃、120r·min-1的摇床上厌氧培养10-12h；然后将菌液离心、洗涤，重悬浮于富磷无碳的灭菌驯化培养基B中，通入无菌空气好氧培养8-12h后结束本轮厌氧/好氧循环，重复上述厌氧/好氧循环3-5次，得到驯化菌。所述步骤(1)中富集培养基为每L含3g牛肉膏、10g蛋白胨、5gNaCl、0.02gKH2PO4，及1mL微量元素。所述步骤(2)中富碳限氮驯化培养基A为：每L含4.92gCH3COONa、13.6gKH2PO4、160mgNH4Cl、0.27mgFeSO4、184mgMgSO4、2mgCaCl2、1mL微量元素。所述步骤(2)中富磷无碳的灭菌驯化培养基B为每L含13.6gKH2PO4、160mgNH4Cl、0.27mgFeSO4、184mgMgSO4、2mgCaCl2、1mL微量元素。所述微量元素均为：每L含5gEDTA、5gFeSO4·7H2O、1.6gCuSO4·5H2O、5gMnCl2·4H2O、50mg(NH4)6Mo7O24·4H2O、50mgH3BO3、10mgKI和50mgCoCl2·6H2O。所述步骤(2)中驯化菌应用于除磷，具体为：菌液离心，洗涤后接种于废水中，然后进行厌氧、好氧交替培养，分别在厌氧培养结束时以及好氧培养过程取5ml菌液，离心，测定菌液离心液中的释磷量、吸磷量以及COD。所述厌氧5h，好氧3h。所述步骤(2)中容器为具橡皮塞的血清瓶，塞紧橡皮塞并用扎带紧固后，插入灭菌后的长、短二根针头，长针头需达到瓶底。本专利技术所提供的菌株P.PAO-1，具有以下表型特征：在30℃条件下，牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养48小时后，菌落为圆形，直径为2mm左右，中间隆起，边缘波形；菌落透明、湿润，表面光滑，有鱼腥臭味；早期颜色较浅，为乳白色，后期颜色加深且偏黄；通过革兰氏染色后在显微镜下呈阴性，菌体呈杆状或略微弯曲，细菌两端钝圆，大小为(0.5-0.7μm)×(1.4-2.6μm)，大多数菌体单独出现；细菌在除磷液态检测培养基好氧生长过程中，菌体易产生团聚现象，对团聚体染色观察，部分团聚体外缘菌体周围可形成丝状鞭毛。本专利技术所提供的菌株P.PAO-1，具有以下生理生化特性：接触酶、氧化酶、吲哚、硝酸盐还原反应结果为阳性，不产H2S、淀粉水解M.R试验、V.P试验、明胶液化试验结果为阴性，可利用葡萄糖发酵。本专利技术中的菌株P.PAO-1在利用普通牛肉膏蛋白胨培养基长期保存后，可利用本专利技术提出的富集-驯化二阶段培养模式法来提高菌量以及菌体内PHB的贮存量。与不采用该培养法的对照组相比，经过富集-驯化二阶段培养模式培养的菌株P.PAO-1可在菌体内形成PHB初始积累，促使菌株P.PAO-1能够在厌氧条件下吸收较低浓度的乙酸根，将其转化为聚羟基丁酸(PHB)在菌体内贮存，并且在好氧条件过量吸收废水中的磷，将其转化为聚磷颗粒贮存在体内，而不仅仅依靠细菌细胞增殖来吸收废水中的磷，从而达到从普通的低浓度含碳有机废水强化除磷的目标。菌株P.PAO-1的16SrRNA基因序列特征：其16SrRNA具有如序列表1中所示的核苷酸序列，序列长度为1444bp，Genbank中的登录号为KF591092。根据其形态特征和生理生化特征及其16SrRNA基因序列在Genbank中的检索结果，鉴定菌株P.PAO-1为恶臭假单胞菌(PseudomonasPutida)。本专利技术中的具有除磷功能的恶臭假单胞菌(Pseudomonassp.)P.PAO-1已于2013年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏号为CGMCCNo.8073，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。有益效果本专利技术所提供的恶臭假单胞菌菌株P.PAO-1能够利用有机物在其体内合成PHB，并在好氧条件下，氧化贮存在体内的PHB同时释放能量，恶臭假单胞菌菌株P.PAO-1利用这部分能量吸收远远超过其生理需要的磷，在其体内合成多聚磷酸盐(poly-p)及其糖原等其它多本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有除磷功能的恶臭假单胞菌P.PAO‑1，其特征在于：所述恶臭假单胞菌(pseudomonas sp.)P.PAO‑1的保藏编号为：CGMCC No.8073，其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种具有除磷功能的恶臭假单胞菌P.PAO-1的驯化培养方法，包括：(1)将恶臭假单胞菌P.PAO-1的菌种接种于5-10ml灭菌富集培养基预培养，然后再接种于100-200ml灭菌富集培养基内，在30℃条件下，震荡培养12-24h，清洗，离心，重悬浮形成菌液，菌液OD为1.0-1.3；其中恶臭假单胞菌(pseudomonassp.)P.PAO-1的保藏编号为：CGMCCNo.8073，其16SrRNA序列如SEQIDNO.1所示；富集培养基为每L含3g牛肉膏、10g蛋白胨、5gNaCl、0.02gKH2PO4，及微量元素；(2)将菌液转移至装有100-200ml灭菌富碳限氮驯化培养基A的容器中，控制菌液细菌细胞浓度约为1.5g干细胞/L，通入氮气5-30min赶尽容器内空气，并将其置于30℃、120r·min-1的摇床上厌氧培养10-12h；然后将菌液离心、洗涤，重悬浮于富磷无碳的灭菌驯化培养基B中，通入无菌空气好氧培养8-12h后结束本轮厌氧/好氧循环，重复上述厌氧/好氧循环3-5次，得到驯化菌；其中富碳限氮驯化培养基A为：每L含4.92gCH3COONa、13.6gKH2PO4、16...
【专利技术属性】
技术研发人员：田晴，朱艳彬，谢学辉，杨波，李方，秦华星，张成，王康伟，黄娜，庄林杰，孟丹杰，王琦，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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