本发明专利技术属于医学动物模型技术领域，具体为一种家兔肾脏在体低温机械灌注模型及其构建方法。作为一种研究工具，该模型复制肾移植低温机械灌注过程，其特点是采用了在体自体肾移植方式，构建步骤包括：术前准备；麻醉、固定、备皮，常规开腹；夹闭肾蒂腹腔探查；再灌注；在体模拟肾脏体外低温机械灌注（MP）保存；血管缝合；膀胱造瘘；右肾切除；关闭腹腔；术后维持。本模型消除了由同种异体的供肾所导致的免疫排斥反应，同时由于并未将肾脏完全离体，这使得血管缝合变得简单，缝合时间缩短，血管损伤减少，当用于研究MP机制时，减少了这些因素的干扰，且该模型操作简单、可重复性好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学动物模型
，具体涉及一种家兔肾脏在体低温机械灌注模型的构建方法。
技术介绍
肾移植是治疗终末期肾病最有效的手段。据统计，中国目前每年进行肾移植5000例左右【1】，但日益严重的供肾匮乏困扰着广大患者及移植医生。为此，卫生部自2010年起开始启动心脏死亡器官捐献(donat1n after cardiac death，DO))试点工作，运行良好，自2015年I月I日起，公民逝世后器官捐献已成为供体的唯一来源。但D⑶相比于脑死亡供者(donor after brain death, DBD)来说存在一些缺点【2】。例如，D⑶供体器官热缺血时间较长，导致术后移植物原发性无功能(primarynonfunct1n，PNF)或功能延迟恢复(delayed graft funct1n，DGF)的发生率高【3】。此外，供肾保存方式对移植后肾功能恢复亦有影响。多个移植中心报道传统静态冷储保存的DCD供肾移植受者移植肾功能延迟恢复(delayed graft funct1n, DGF)发生率高达40%?90%【4-5】。DGF是肾移植术后早期常见并发症，常导致受者和移植肾长期存活率降低【6】，发生DGF受者I年生存率低于未发生DGF受者(74%与90% )【7】。鉴于此，随着边缘供者和D⑶供肾的增加，传统的静态冷储(cold storage，CS)已经无法应对新形势下的保存需求，故新的保存策略肾脏低温机械灌注(machine perfus1n，MP)得到推崇。多个国际随机临床试验均证实，MP相比CS来说，可以明显降低脑死亡、D⑶和扩大标准供体(E⑶)的DGF发生率、提高移植物的I年生存率和3年生存率。从理论上讲，MP可能促进毒素的排泄和提供营养；MP也可以减少血管痉挛但是没有直接证据；MP能够将灌注液从肾动脉灌入到肾脏内部，起到冲刷血管，保护血管床的作用。但MP的保护机制仍然不为人所知。为了进一步研宄机制，稳定可靠、重复性高的动物模型成为首选。目前，低温机械灌注模型多以猪、犬等大型动物为研宄对象，如:AnjaGallinat、Nader Vaziri等人分别做过同种异体猪肾移植和Susanne Lindell等人用犬来研宄UW液的保护供肾的作用【8-10】。Hauet T等人于2000年在J Am Soc N印hrol发表过一篇关于猪的自体肾移植的模型制作方法的文章，他选用的手术方式为自体肾移植，其意义在于消除了由同种异体的供肾所导致的免疫排斥反应，排除免疫系统的干扰，但存在缝合时间长，血管损伤大的缺陷，对于观察MP的保护机制仍有影响【11】。另外，参照临床肾移植的整个过程，是否能在小型动物上模拟人体DCD肾移植全过程？家兔，相较于大小鼠，其实验难度减少，虽然Gregory M.Fahy和Suja E.Ali做过家兔肾脏常温灌注【12】，但未见有利用家兔为模型基础来研宄低温机械灌注机制的报道。因此，我们提出了家兔肾脏在体低温机械灌注模型，希望能够为将来MP机制的研宄提供稳定的模型基础。参考文献:1、全国器官移植概况暨数据质量核查。中国肾移植科学登记系统，2011。 http://www.haven, net.cn/main/index, d0.2、Deng，R.，GujG.，Wang, D.，et al.Machine perfus1n versus cold storageof kidneys derived from donat1n after cardiac death: a meta-analysis.PLoS.0ne.8，e56368 (2013).3、Tsoulfas，G., Nagelschmidtj M., Minor, T., et al.Commentary on: Lipidperoxidat1n in machine perfus1n of older donor kidneys.J.Surg.Res.185，e43-4 (2013).4、FarneyAC， Singh RPj Hines MH ， et al.Experience in renal and extrarenaltransplantat1n with donat1n after cardiac death donors with selective use ofextracorporeal support.J Am Coll Surgj 206(5): 1028-1037 (2008).5、Barlow ADj Metcalfe MS, Johari Y， et al.Case-matched comparisonof long-term results of non-heart beating and heart-beating donor renaltransplants.Br J Surgj 96(6): 685-691 (2009).6、Halloran PFj Hunsicker LG.Delayed graft funct1n: state of the art.AmJ Transplant, 1 (2): 115-120(2001).7、MoersC， Smits JMj Maathuis MHj et al.Machine perfus1n or cold storagein deceased-donor kidney transplantat1n.N Ensl J Medj 360(1): 7-19 (2009).8、Gallinat，A.，Fox,M.，Llierj B.，et al.Role of pulsatility in hypothermicrecondit1ning of porcine kidney grafts by machine perfus1n after coldstorage.Transplantat1n 96， 538-42 (2013).9λ Vazirij N., Thuillierj R., Favreauj F.D., Eugene, M., Milinj S.&Chatauretj N.P.Analysis of machine perfus1n benefits in kidney grafts: apreclinical study.J.Transl Med.25，9-15 (2011).10、Lindell，S., Nobel, M., Rankin, M., et al.0ptimal pH for simple coldstorage or machine perfus1n of dog kidneys with Uff solut1n.Transpl.1nt.11，208-11 (1998).1K Hauetj T., Goujon, J.M.，Vandewallej A., et al.Trimetazidine reducesrenal dysfunct1n by limiting the cold ischemia/reperfus1n injury inautotransplanted pig k本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种家兔肾脏在体低温机械灌注模型的构建方法，其特征在于具体步骤如下：（1）术前准备每次挑选两只3.2‑3.8kg的雄性家兔在术前36‑48h撤去饲槽，术前禁食36‑48h，但需要给予充足水分；（2）麻醉、固定、备皮，常规开腹（3）夹闭肾蒂 腹腔探查 用棉垫和纱布保护切口边缘，将腹腔内脏器稍向右扒开，用纱布遮盖，用45.0℃生理盐水时刻保湿保温；暴露左肾并游离左输尿管；钝性分离肾动静脉，注意分离静脉时，动作轻柔，防止拉伤撕破；分离动脉时，要确定有无动脉畸形或多支动脉，动脉鞘要分离干净，分离长度为1.5‑2cm；分离完成后，用动脉夹先夹闭输尿管再同时夹闭肾动静脉，在夹闭的一瞬间，同时开始计时,夹闭时间为25min或35min；用组织钳简易夹闭切口皮肤，关闭腹腔，维持家兔基础体温（38±0.5℃）；从左耳缘静脉抽取血液，进行血气分析；（4）再灌注 在到达夹闭时间之前1min松开组织钳，打开腹腔及暴露左肾，在到达夹闭时间那一刻松开两个动脉夹；观察肾脏颜色质地，理应见到肾脏变红变软，无瘀斑，动脉恢复搏动，注意保护肠道，并开始计时，用组织钳简易夹闭切口皮肤，关闭腹腔，维持家兔基础体温，再灌注时间为1小时；（5）模拟肾脏体外低温机械灌注保存 在到达1小时之前，提前30min松开组织钳，打开腹腔及暴露左肾，注意保护肠道，此时将5%葡萄糖溶液换成羟乙基淀粉溶液，静注，做腹部横向切口，切缘与左肾蒂平行，长度为7‑9cm，使横向切口与原切口呈横“T”形，并止血，止血完成后，右耳缘静脉推注0.3ml（1875 IU）肝素，推注完成后开始准备肾动脉穿刺装置（静脉留置针、输液器及4℃肝素化的枸橼酸肾脏保护液）；游离左肾，将左肾与周围组织分离，切勿将输尿管及肾蒂切断，并结扎止血，防止周围组织渗血；在1h到达的时刻，用动脉夹同时夹闭肾动静脉，再用另一只动脉夹夹闭输尿管，然后在肾动脉上带上两根3‑0慕思线备用，左手牵近心端的线，右手使用静脉留置针穿刺肾动脉；准备碎冰、4℃枸橼酸肾脏保存液及肾袋；穿刺完成后，打开输液器，待肾脏颜色变白后，用留置针的针头轻轻点刺肾静脉，此时有水柱涌出，观灌注速度，防止留置针滑脱或阻塞，然后结扎远心端，注意不要过紧或过松，防止滑脱，再结扎近心端；将肾套在肾袋内，向肾袋内注入4℃枸橼酸肾脏保存液同时收住肾袋口，不宜过紧，防止留置针阻塞；注意观察流注速度，确定流注速度未变化后，适当移动兔子的位置，使左肾能从横向切口中牵出体外，切记不要拉断肾动静脉和输尿管；将保存有肾脏的肾袋脱出家兔左侧体外，在体保存在装有冰水混合物的圆盘中，此时可以装上lifeport灌注仪，进行低温机械灌注保存，完成后，缝合“T”型伤口和腹部正中切口皮肤，恢复腹温，时刻观察lifeport灌注仪的灌注流量及机器运转状况（压力为60mmHg，流量控制在15‑20ml/min），此时可以将羟乙基淀粉溶液换成5%葡萄糖溶液，在体进行肾脏机械灌注4h, 在这4h内监测家兔生命体征，时刻保持盘子内有充足的碎冰，确定引流管通畅，保存到第2h时，进行第二次血气分析；（6）血管缝合 在到达4h之前，提前20min检测第三次血气分析，同时准备50ml 4℃乳酸林格氏溶液，5ml碳酸氢钠，2ml肝素，2ml呋噻米，50ml肝素氯化钠和50ml 4℃生理盐水；提前5min打开正中切口及左腹横向切口，撤去lifeport灌注仪，停止灌注，同时换上羟乙基淀粉，静注1秒/滴；向肾脏中注入4℃乳酸林格氏溶液50ml以冲走残留于肾脏中的枸橼酸肾脏保存液；使用10‑0带针缝合线先进行静脉缝合，再将动脉留置针取出后用10‑0带针缝合线进行动脉缝合，在缝合血管时，要时刻注意肠道的保湿保温，并留意兔子的生命体征，血管缝合完毕后，肾动静脉远心端夹闭试漏，即打开两只动脉夹，确定动静脉有无出血，有无狭窄，恢复肾脏血供，此时耳缘静脉推注0.2ml肝素、0.5ml呋塞米和慢推5ml 5%碳酸氢钠，观察兔子的生命体征和肾脏状况，进行第四次血气分析；逐层细致关闭左腹横向切口，此时，准备造瘘管；（7）膀胱造瘘 确定造瘘位置，使用荷包缝合法，不要拉伤膀胱，此时耳缘静脉推注呋塞米；（8）右肾切除 分离右肾蒂并双重结扎，分离输尿管并双重结扎，游离肾周围组织，结扎止血，剪断肾蒂和输尿管，右肾切除，止血，此时耳缘静脉推注呋塞米；（9）关闭腹腔 清点器械，腹腔冲洗后逐层细致关闭腹腔，此时应将羟乙基淀粉换成乳酸林格氏溶液，静注；松开家兔固定装置，用吹风机将兔子吹干，尽快恢复体温；（10）术后维持术后24h内监测兔子的生命体征，尿量及血气分析，及时纠正酸碱平衡紊乱，补足血容量，有助于恢复左肾脏功能。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：钟自彪，叶啟发，王彦峰，王忍，付贞，张洋，刘忠忠，兰佳男，杨自轩，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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