薄树芝中的多糖及其提取方法和应用技术

本发明专利技术公开了薄树芝中的多糖及其提取方法和用途，该方法为以薄树芝菌丝粉为原料，通过水提醇沉提取和碱提的结合、Sevag法脱蛋白、DEAE纤维素柱层析、Sephadex 柱层析等获得多糖纯品，结构分析显示此法得到的薄树芝多糖有杂多糖和均多糖，分子量范围1000-200000Da。该提取方法在比较温和的条件下进行，完好的保存了多糖的组分，所得多糖结构明确，质量可控。该薄树芝多糖在免疫增强、抗肿瘤方面具有显著效果，同时，本发明专利技术得到的多糖纯品，在抗氧化实验中显示其具有DPPH·和OH·自由基清除活性，这些可为将来在食品、化妆品、保健品、医药等领域应用中提供依据。

【技术实现步骤摘要】
薄树芝中的多糖及其提取方法和应用
本专利技术属于医药及保健食品
，具体涉及植物粗多糖、纯多糖及其制备方法和用途。
技术介绍
薄树芝（GanodermaCapense（Lloyd）Teng）为灵芝亚属真菌薄树芝的菌丝体，又称薄盖灵芝、薄芝，是多孔菌科灵芝属真菌。性微甘、寒，能清热、消炎，主治肝炎、肿瘤等，广泛分布于中国、日本、韩国等亚洲国家。据报道，薄树芝的化学成分有嘌呤、嘧啶、D-甘露醇、凝集素、生物碱，麦角甾醇、麦角甾醇棕榈酸酯、麦角甾-7,22-二烯-(3)酮、麦角甾-7、22-二烯-3β-醇、5α-豆甾烷-(3,6)二酮、β-谷甾醇等甾体化合物，菜豆皂苷元-B，以及花生酸、硬脂酸、廿二碳烷酸、廿三碳烷酸、廿四碳烷酸等饱和脂肪酸，蛋白质、氨基酸、多糖、脂肪酸及丰富的矿质元素等。其中，主要活性物质是薄树芝中的多糖、糖肽类成分。研究表明，薄树芝提取物具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、调节心血管系统、护肝解毒、镇静、降血糖等方面的活性。作为主要活性成分的薄树芝多糖具有潜在的开发应用价值。但是由于其环境要求高，自然资源破坏严重等因素，使得薄树芝资源越来越稀缺。据报道，从真菌薄树芝中分离的菌种并经现代生物工程技术深层发酵所得的干燥粉末中，多糖含量比野生薄树芝大大提高，而作为主要活性成分的薄树芝多糖具有潜在的开发应用价值，所以提取、分离、纯化薄树芝多糖就显得尤为重要，总多糖含量及纯度较高的薄树芝多糖可为其药理和制剂提供原料。目前，国内外对薄树芝的研究则主要集中为对薄芝糖肽的药理活性，对薄树芝多糖的研究还不够深入，同时关于薄树芝发酵产物多糖的研究也鲜有报道。为了进一步开发薄树芝这一宝贵资源，发掘新药源，本专利技术以经过深层发酵的薄树芝菌粉为原料，采用水提醇沉法得到粗多糖，对提取的粗多糖进行脱蛋白，然后利用离子交换层析和凝胶分子筛柱层析方法纯化薄树芝多糖，首次制备出五种薄树芝多糖纯品，并且对五种组分多糖的理化性质、分子量、单糖组成等进行了系统的分析鉴定，并成功得出了五个组分的重复单元结构。本专利技术得到的多糖样品在免疫增强、抗肿瘤方面具有显著效果，同时，在抗氧化实验中显示其具有DPPH·和OH·自由基清除活性，这些可为将来在食品、化妆品、保健品、医药等领域应用中提供依据。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供薄树芝多糖的提取方法。本专利技术的另一目的在于提供新发现的薄树芝多糖。本专利技术所采取的技术方案是：一种薄树芝多糖GCP-1，该多糖GCP-1是由葡萄糖单糖组成的葡聚糖，多糖的主链由→4)-α-D-Glc-(1→和→4,6)-α-D-Glc-(1→组成，支链由α-D-Glc-(1→组成，GCP-1的结构为：，其中n为12～20。一种薄树芝多糖GCP-2，该多糖GCP-2是由葡萄糖单糖组成的葡聚糖，多糖的主链由→4)-α-D-Glc-(1→和→4,6)-α-D-Glc-(1→组成，支链由α-D-Glc-(1→组成，GCP-2的结构为：，其中n为4～7。一种薄树芝多糖GCP-4，该多糖GCP-4是由葡萄糖单糖组成的葡聚糖，多糖的主链由→4)-α-D-Glc-(1→和→4,6)-α-D-Glc-(1→组成，支链由α-D-Glc-(1→组成，GCP-4的结构为：，其中n为2～5。一种薄树芝多糖GCP-3，该多糖GCP-3是由β-L-吡喃构型的阿拉伯糖和β-D-吡喃构型的木糖组成的杂多糖，且以1→4健型作为连接方式，GCP-3的结构为：，其中n为120～130。一种薄树芝多糖GCP-5，该多糖GCP-5是由阿拉伯糖和木糖以1:1比例组成的杂多糖，其主链由→3，4)-β-D-Xyl-(1→组成，支链由β-D-Xyl-(1→、→3)-β-L-Ara-(1→和→4)-β-L-Ara-(1→组成，GCP-5的结构为：，其中n为122～132。薄树芝中多糖的提取方法，该方法包括以下操作步骤：1）脱脂：将薄树芝菌粉脱脂，晾干；2）水提：将脱脂后的薄树芝菌粉进行水提，分别收集提取液和残渣；3）分级醇沉：将提取液浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为a%，静置，收集沉淀，即得粗多糖Pa；将上清液再次浓缩，加入乙醇使乙醇体积浓度为b%，静置，收集沉淀，即得粗多糖Pb；将上清液再次浓缩，加入乙醇使乙醇体积浓度为b%，静置，收集沉淀，即得粗多糖Pc；其中10≤a＜b＜c＜100；4）碱提：将水提后的残渣浸泡于0.1～1MNaOH溶液中，静置1～4h，上清液用0.1～1MHCl进行中和使上清液的pH为6～8，离心取上清，浓缩上清，加入乙醇使乙醇体积浓度为50～90%，静置，收集沉淀，即得碱提粗多糖PB；5）纯化：对上述粗多糖Pa、Pb、Pc、PB进行纯化，即得薄树芝多糖。进一步的，步骤1）中所述脱脂选用2～8倍体积的石油醚对薄树芝菌粉进行脱脂；进一步的，步骤2）中所述水提的具体操作为用5～15倍体积的60~100℃热水对薄树芝菌粉进行提取，提取时间1～4h。进一步的，步骤3）中所有所述浓缩为40～70℃真空浓缩，所有所述静置的时间为10～28h。进一步的，将步骤5）中纯化后的多糖Pa、Pb、Pc、PB分别进行离子交换柱层析，用0～1.5MNaCl进行梯度洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集有效部分，浓缩，冷冻干燥；然后，分别用水进行溶解，离心，取上清液进行分子筛凝胶柱层析，用水进行洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线收集有效部分，浓缩，冷冻干燥后获得五种多糖纯品，分别命名为GCP-1、GCP-2、GCP-3、GCP-4和GCP-5，其中GCP-1来自多糖Pb中，GCP-2来自多糖Pc中，GCP-3、CPP-4、GCP-5来自于多糖PB中。薄树芝多糖，该多糖的提取方法为上述所述的方法。本专利技术的有益效果是：1.与传统水煮法提取多糖相比，本专利技术采用水提醇沉法和碱提法的结合，乙醇浓度由低到高进行分级醇沉，对薄树芝多糖进行初步分离，同时高浓度乙醇能将极性大、水溶性好的多糖与极性小、水溶性差的多糖分离，使所提取的多糖组合物含有更多种类的多糖成分。且本制备工艺简单且可以大规模生产。2.本专利技术中通过柱层析法对薄树芝粗多糖进行分离纯化，效果显著，首次制备出五种薄树芝多糖纯品。3.本专利技术对制备出的五种多糖结构进行了鉴定，明确了各多糖组分的理化性质及结构，并进一步研究各组分的药理活性，能使薄树芝多糖尽快转化为医药和保健食品，造福于社会。4.本专利技术提取方法在比较温和的条件下进行，完好的保存了多糖的组分，所得多糖结构明确，质量可控。该薄树芝多糖在免疫增强、抗肿瘤方面具有显著效果，同时，本专利技术得到的多糖纯品，在抗氧化实验中显示其具有DPPH·和OH·自由基清除活性，这些可为将来在食品、化妆品、保健品、医药等领域应用中提供依据。附图说明图1为GCP-5的HPGPC色谱图；图2为GCP-5的红外图谱图；图3为GCP-5的13CNMR图谱；图4为GCP-5的1HNMR图谱；图5为GCP-5的HMQC图谱；图6为GCP-5的HMBC图谱；图7为GCP-5对DPPH·的清除作用。具体实施方式薄树芝中多糖的提取方法，该方法包括以下操作步骤：1）脱脂：将薄树芝菌粉脱脂，晾干；2）水提：将脱脂后的薄树芝菌粉进行水提，分别收集提取液和残渣；3）分级醇沉：将提取液浓缩后，加本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种薄树芝多糖GCP‑1，其特征在于：该多糖GCP‑1是由葡萄糖单糖组成的葡聚糖，多糖的主链由→4)‑α‑D‑Glc‑(1→和→4,6)‑α‑D‑Glc‑(1→组成，支链由α‑D‑Glc‑(1→组成，GCP‑1的结构为：，其中n为12～20。

【技术特征摘要】
1.一种薄树芝多糖GCP-1，其特征在于：该多糖GCP-1是由葡萄糖单糖组成的葡聚糖，多糖的主链由→4)-α-D-Glc-(1→和→4,6)-α-D-Glc-(1→组成，支链由α-D-Glc-(1→组成，GCP-1的结构为：，其中n为12～20。2.一种薄树芝多糖GCP-2，其特征在于：该多糖GCP-2是由葡萄糖单糖组成的葡聚糖，多糖的主链由→4)-α-D-Glc-(1→和→4,6)-α-D-Glc-(1→组成，支链由α-D-Glc-(1→组成，GCP-2的结构为：，其中n为4～7。3.一种薄树芝多糖GCP-4，其特征在于：该多糖GCP-4是由葡萄糖单糖组成的葡聚糖，多糖的主链由→4)-α-D-Glc-(1→和→4,6)-α-D-Glc-(1→组成，支链由α-D-Glc-(1→组成，GCP-4的结构为：，其中n为2～5。4.一种薄树芝多糖GCP-3，其特征在于：该多糖GCP-3是由β-L-吡喃构型的阿拉伯糖和β-D-吡喃构型的木糖组成的杂多糖，且以1→4键型作为连接方式，GCP-3的结构为：，其中n为120～130。5.一种薄树芝多糖GCP-5，其特征在于：该多糖GCP-5是由阿拉伯糖和木糖以1:1比例组成的杂多糖，其主链由→3，4)-β-D-Xyl-(1→组成，支链由β-D-Xyl-(1→、→3)-β-L-Ara-(1→和→4)-β-L-Ara-(1→组成，GCP-5的结构为：，其中n为122～132。6.薄树芝中多糖的提取方法，其特征在于：该方法包括以下操作步骤：1）脱脂：将薄树芝菌粉脱脂，晾干；2）水提：将脱脂后的薄树芝菌粉进行水提，分别收集提取液和残渣；3）分级醇沉：将提取液浓缩后，加入乙醇使乙醇体积浓度为a%，静置，收集沉...

【专利技术属性】
技术研发人员：严春艳，黄雅婷，黎乃生，
申请(专利权)人：广东药学院，
类型：发明
国别省市：广东;44