本发明专利技术属于中药提取物的制备技术领域，具体公开了一种核桃活性多肽提取物的制备方法及应用。本发明专利技术制备方法的具体步骤包括：去皮核桃仁用碱溶酸沉法提取、离心、冷冻干燥后获得核桃蛋白冻干粉，依次加入中性蛋白酶、碱性蛋白酶酶解，离心取上清液，稀释后用凝胶层析分离，收集分子量3000-1000D的组分，冷冻干燥即得核桃活性多肽冻干粉。本发明专利技术采用复合酶酶解和凝胶色谱方法制备核桃活性多肽，具有条件温和、工艺简单、安全性高、绿色环保等优点；所制备的核桃活性多肽具有明显的口服降糖、降脂作用，可以用于制备糖尿病、高血脂的预防和治疗药物或保健食品及食品。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及中药提取物的制备
，具体涉及一种核桃活性多肽提取物的制 备方法及应用。
技术介绍
生物活性肽的制备，通常有三种方式：一是从自然界的生物体中直接提取其本身 固有的天然活性肽；二是通过蛋白质降解获得具有生理功能的活性肽；三是利用化学、酶 合成和重组DNA法合成法制备生物活性肽。但由于直接提取法和化学合成法存在产量低、 成本高、污染大等缺点，因此采用酶法水解蛋白来制备生物活性肽是一种比较合理的途径， 具有条件温和、工艺简单、安全性高、对蛋白质和多肽的品种影响小、无有机溶剂污染等明 显的优越性。 核桃（JuglansregiaL.)又名胡桃、羌桃，《神农本草经》将其列为久服轻身益气、 延年益寿的上品。《本草纲目》记述，核桃仁有"补气养血，润燥化痰，益命门，处三焦，温肺 润肠，治虚寒喘咳，腰脚重疼"等功效。 目前临床常用糖尿病药物长期服用会产生耐药性、抗药性、肝肾损伤等副作用，同 时伴有体重增加、低血糖等不良反应，而生物多肽类药物具有活性好、疗效高、分子量小、副 作用少等独特的优势，为糖尿病的预防和治疗开辟了新的思路。核桃仁中蛋白质含量丰富， 结合现代化学与药理研宄成果，对核桃多肽类成分加以开发利用，发掘糖尿病防治新药，将 拓展核桃资源的应用范围。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足，本专利技术的第一个目的是提供了一种核桃活性多肽提 取物的制备方法，该方法通过碱溶酸沉获得核桃蛋白，通过复合酶酶解、凝胶层析、冷冻干 燥等步骤从核桃中获得核桃活性多肽提取物。 本专利技术的另一个目的是提供了一种上述方法制备的核桃活性多肽提取物在制备 糖尿病、高血脂的预防和治疗药物或保健食品及食品中的应用。 本专利技术的第一个目的通过如下技术方案来实现： 一种核桃活性多肽提取物的制备方法，步骤如下： (1)取核桃仁，加0. 4-0. 8w/w%NaOH溶液浸泡20-40分钟，取出核桃仁，去皮，粉 碎成核桃仁粗粉； 优选的，所述NaOH浓度为0. 6w/w%，浸泡时间为30分钟； (2)向步骤（1)所得核桃仁粗粉中加入4-8倍重量的0. 4-0. 8w/w%NaOH溶液浸 泡过夜，冷冻离心，收集中间水层，然后用0.lmol/LHC1调节pH至4. 0-4. 5,冷冻离心，收集 沉淀，冷冻干燥，即得核桃蛋白冻干粉。 优选的，所述0. 4-0. 8w/w%NaOH溶液用量为核桃仁粗粉重量的6倍，NaOH溶液浓 度为 0? 6w/w% ; 优选的，步骤（2)中所述冷冻离心条件为4°C、4000转/分钟下离心30分钟； 经测定，在步骤（1)和（2)优选的条件下，所得的核桃蛋白冻干粉中蛋白质的含量 为 92. 6w/w% 〇 (3)将步骤（2)所得核桃蛋白冻干粉用蒸馏水稀释至相当于含蛋白质2g/100mL的 溶液，按酶底比1: (4-11)加入中性蛋白酶，用0.lmol/LHC1调节pH至7. 0,在48°C下酶解 0. 5-1. 5小时，灭酶，冷却至室温； 步骤（3)中所述酶底比为中性蛋白酶与核桃蛋白冻干粉中所含蛋白质的质量比； 所述中性蛋白酶的活力为60000u/g ; 优选的，步骤（3)中所述酶底比为1:7. 5 ; 优选的，步骤（3)中所述酶解时间为1小时； 优选的，步骤（3)中所述灭酶条件为95°C、15分钟； (4)向步骤⑶所得溶液中按酶底比1: (4-8)加入碱性蛋白酶，用0.lmol/LNaOH 调节pH至9.0,在55°C下酶解1-3小时，灭酶，冷却至室温，冷冻离心，收集上清液； 所述酶底比为碱性蛋白酶与步骤（2)所得核桃蛋白冻干粉中所含蛋白质的质量 比； 所述碱性蛋白酶的活力为60000u/g ; 优选的，步骤（4)中所述酶底比为1:6 ; 优选的，步骤（4)中所述酶解时间为2小时； 优选的，步骤（4)中所述灭酶条件为95°C、15分钟； 优选的，步骤（4)中所述冷冻离心条件为4°C、4000转/分钟下离心30分钟； (5)将步骤（4)收集的上清液用蒸馏水稀释至为含多肽3-7mg/mL的溶液（命名为 "稀释液")，用葡聚糖凝胶层析分离，收集分子量3000-1000D的组分，冷冻干燥，即得到核桃 活性多肽提取物冻干粉。 优选的，将步骤（4)收集的上清液用蒸馏水稀释至为含多肽5mg/mL的溶液，用 葡聚糖凝胶层析分离的条件为：凝胶色谱柱（SuperdexPeptide10/300GL)，流动相为 0? 2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7. 4,含0? 15mol/LNaCl)，流速0? 5mL/min;经峰面积计算，收 集的分子量3000-1000D的组分占前述稀释液总质量的82. 7-94. 7%，得到的核桃活性多肽 提取物冻干粉中总多肽含量为43. 4-53. 6w/w%。 根据上述制备方法得到的核桃活性多肽提取物，可用于制备预防或治疗糖尿病、 尚血脂的药物或保健食品及食品。 与现有技术相比，本专利技术的优点和有益效果在于： 本专利技术提高了核桃资源的利用率，开辟了其新的药用、食用途径。本专利技术所得的核 桃活性多肽提取物具有明显的口服预防和治疗糖尿病、高血脂的作用。【具体实施方式】 下面结合具体实施例进一步阐述本专利技术的核桃活性多肽提取物的制备方法及其 应用。 以下实施例中所用核桃仁均为常规市售中药材及干果食品。 以下实施例中所用中性蛋白酶的活力为60000u/g (100g/瓶，武汉市华顺生物技 术有限公司）。 以下实施例中所用碱性蛋白酶的活力为60000u/g(100g/瓶，武汉市华顺生物技 术有限公司）。 以下实施例中所用葡聚糖凝胶层析柱均为：SuperdexPeptide10/300GL(GE公 司 实施例1 : 一种核桃活性多肽提取物的制备方法，步骤如下： (1)取核桃仁，加入0. 6w/w%NaOH溶液浸泡30min，取出核桃仁，去皮，粉碎成核桃 仁粗粉； (2)向核桃仁粗粉中加入其4倍重量的0. 6w/w%NaOH溶液浸泡过夜，4°C、4000 转/分钟下离心30分钟，收集中间水层，然后用0.lmol/LHC1调节pH至4. 0-4. 5,在4°C、 4000转/分钟下离心30分钟，收集沉淀，冷冻干燥，即得核桃蛋白冻干粉。经测定，所得核 桃蛋白冻干粉中蛋白质含量为88. 7w/w%。 (3)将核桃蛋白冻干粉用蒸馏水稀释至相当于含蛋白质2g/100mL，按酶底比 1:7. 5加入中性蛋白酶，用0.lmol/LHC1调节pH至7.0,在48°C下酶解0.5小时，95°C、15 分钟灭酶，冷却至室温； (4)向步骤⑶所得溶液中按酶底比1:6加入碱性蛋白酶，用0.lmol/LNaOH调节 pH至9. 0,在55°C下酶解1小时，95°C、15分钟灭酶，冷却至室温，然后在4°C、4000转/分 钟下离心30分钟，收集上清液； (5)将步骤⑷收集的上清液用蒸馏水稀释成含多肽3mg/mL的溶液，用葡聚糖 凝胶层析（SuperdexPeptide10/300GL柱，流动相为0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4， 含0. 15mol/LNaCl)，流速0. 5mL/min，进样量0. 5mL，检测波长280nm)分离，收集分子量 3000-1000D的组分。经峰面积计算，所收集的组分占总面积的85. 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种核桃活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：（1）取核桃仁，加0.4‑0.8w/w% NaOH溶液浸泡20‑40分钟，取出核桃仁，去皮，粉碎成核桃仁粗粉；（2）向步骤（1）所得核桃仁粗粉中加入4‑8倍重量的0.4‑0.8w/w% NaOH溶液浸泡过夜，冷冻离心，收集中间水层，然后用0.1 mol/L HCl调节pH至4.0‑4.5，冷冻离心，收集沉淀，冷冻干燥，即得核桃蛋白冻干粉；（3）将步骤（2）所得核桃蛋白冻干粉用蒸馏水稀释至相当于含蛋白质2 g/100 mL的溶液，按酶底比1:（4‑11）加入中性蛋白酶，用0.1 mol/L HCl调节pH至7.0，在48℃下酶解0.5‑1.5小时，灭酶，冷却至室温；步骤（3）中所述酶底比为中性蛋白酶与核桃蛋白冻干粉中所含蛋白质的质量比；所述中性蛋白酶的活力为60000 u/g；（4）向步骤（3）所得溶液中按酶底比1:（4‑8）加入碱性蛋白酶，用0.1 mol/L NaOH调节pH至9.0，在55℃下酶解1‑3小时，灭酶，冷却至室温，冷冻离心，收集上清液；步骤（4）所述酶底比为碱性蛋白酶与步骤（2）所得核桃蛋白冻干粉中所含蛋白质的质量比；所述碱性蛋白酶的活力为60000 u/g；（5）将步骤（4）收集的上清液用蒸馏水稀释至为含多肽3‑7 mg/mL的溶液，用葡聚糖凝胶层析分离，收集分子量3000‑1000 D的组分，冷冻干燥，即得到核桃活性多肽提取物冻干粉。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘阳，阮金兰，李丽，周涵黎，马明兰，谭珺隽，张琳，
申请(专利权)人：武昌理工学院，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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