一种针对甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）的RNA干涉载体及在病毒脱除中的应用制造技术

本发明专利技术涉及针对甘薯褪绿矮化病毒基因RNase3的干涉载体及其在病毒脱除中的应用。甘薯褪绿矮化病毒RNase3基因的干涉载体的构建方法，包括根据甘薯褪绿矮化病毒RNase3基因的核苷酸序列设计两对引物，利用PCR方法将RNase3基因克隆到T载体上，以RNase3-T为模板，分别用设计的两对引物进行PCR扩增，将获得的目的基因RNase3分别用KpnI和XhoI以及SacI和XbaI酶切后，以反向重复的方式分别克隆到pBlue NiRIntron载体的内含子两侧；利用SacI和KpnI双酶切pIntron-RNase3IR载体，回收含RNase3基因反向重复序列的目的片段RNase3IR，将该目的片段克隆到中间载体pROK219上。本发明专利技术针对甘薯上严重发生的SPCSV，成功构建了SPCSV的RNAi载体，并将RNA干扰与茎尖组织培养相结合，建立了甘薯脱毒技术新体系，有效提高了脱除SPCSV的效率和脱毒甘薯品种的产量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，涉及甘薯病毒的干涉载体和病毒脱除技术，特别是涉及针对甘薯褪绿矮化病毒基因沉默抑制子RNase3基因的干涉载体及其在病毒脱除中的应用。
技术介绍
甘薯是重要的粮食、饲料、工业原料和新型能源作物，近年来甘薯的用途越来越受到人们的关注。甘薯病毒病是影响甘薯生产的重要限制因素之一，由于甘薯是无性繁殖作物，容易感染病毒病，一旦感染上病毒病，病毒就会在体内不断增殖、积累、代代相传，使病害逐代加重，造成甘薯产量下降、品质变劣和种性退化，一般可减产30%-50%。甘薯病毒病害(Sweet potato virus diseases，SPVD)是由毛形病毒属(Oiflirirw1S)的甘薯褪绿矮化病毒(Skeei potato chlorotic stunt virus, SPCSV)和马铃薯 Y 病毒属的甘薯羽状斑驳病毒(potato feathery mottleSPFMV)协生共侵染甘薯引起的，感染SPVD的甘薯表现叶片扭曲、畸形、叶片褪绿、明脉以及植株矮化等症状。甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)侵染甘薯是引起SPVD的关键因素。SPVD对甘薯产量影响极大，严重时可造成90%以上的产量损失，甚至绝收，是甘薯最严重的病毒病害之一。对SPCSV目前尚无特别有效的化学防治方法，利用基因工程技术构建SPCSV的RNA干涉(RNAi)载体，培育并种植脱除脱SPCSV的脱毒甘薯是防治SPVD危害的最有效方法之一。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题:克服现有甘薯脱毒技术的缺点，提供一种针对SPCSV的RNA干涉载体及其在病毒脱除中的应用。本专利技术的技术方案:一种针对甘薯褪绿矮化病毒的RNase3基因的干涉载体，构建方法包括以下步骤: (O引物设计:根据甘薯褪绿矮化病毒RNase3基因的核苷酸序列设计两对引物，具体如下:RNase3-Kpn1-5’:5’-GCAGGTACCATGATTCCGATCTTTTCTGATG-3’ ，RNase3-Xho1-3，:5’-CGCCTCGAGTCAATTCAAATTTAGAGCTTCG-3’ ；RNase3-Sac1-5’:5’-TGCGAGCTCATGATTCCGATCTTTTCTGATG-3’ ，RNase3-Xba1-3，:5’-CGGTCTAGATCAATTCAAATTTAGAGCTTCG-3’ ； (2)甘薯褪绿矮化病毒RNA干涉载体的构建: 利用PCR方法将甘薯褪绿矮化病毒的RNase3基因克隆到T载体上，命名为RNase3_T，以RNase3-T为模板，以RNase3-KpnI_5’和RNase3-XhoI_3’为引物，进行PCR扩增，将获得的目的基因RNase3用Kpnl和ZAoI双酶切后，将其克隆到pBlue NiRIntron载体内含子一侧的相应位点； 采用相同方法，以RNase3-T为模板，以RNase3-SacI_5’和RNase3-XbaI_3’为引物，进行PCR扩增，将获得的目的基因RNase3用feci和ZhI双酶切后，将其克隆到pBlueNiRIntron载体内含子另一侧的相应位点，构建成含RNase3基因反向重复序列的载体，命名为 pIntron_RNase3IR ； 然后利用和Kpnl双酶切pIntron_RNase3IR载体，回收含RNase3基因反向重复序列的目的片段RNase3IR，将该目的片段克隆到中间载体pR0K219上，该片段位于35S启动子的下游、NOS终止子的上游，命名为pR0KRNase3IR ； 用&oRI和历《1111酶切pR0KRNase3IR，回收包括35S启动子、RNase3基因反向重复序列和NOS终止子的目的片段35S-RNase3IR-N0S，将该目的片段克隆到植物表达载体pBIN19上，命名为 pBINRNase3IR0RNA干涉载体的两次PCR扩增时的PCR反应体系相同，体积均为50μ1，包括5μ11XPCR buffer,2.5 U Εχ-7^?、?μ1 浓度各为 1mM 的 dNTP 混合物、?μ? 上游引物、?μ?下游引物，其中引物浓度均为ΙΟμΜ，用?μ? RNase3_T质粒作模板，用ddH20补足至50μ1。PCR扩增反应程序为:94°C预变性5min，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸40s，30个循环，最后72°C延伸lOmin。所述的RNA干涉载体在脱除甘薯褪绿矮化病毒中的应用。本专利技术的积极有益效果: (I)本专利技术提供一种针对甘薯褪绿矮化病毒RNase3基因的RNA干涉载体。根据SPCSV编码的RNase3基因序列分别设计两对引物，以质粒RNase3_T为模板，将RNase3基因以反向重复的方式克隆到pBlue NiRIntron载体的内含子两侧，再将含有内含子的反向重复片段插入到中间载体PR0K219上，将包括35S启动子、反向重复片段和NOS终止子目的片段克隆到植物表达载体PBIN19上，成功构建了含有RNase3基因反向重复序列的RNA干涉载体。(2)将本专利技术的RNA干涉载体利用冻融直接转化法转入土壤农杆菌EHA105中，利用农杆菌浸润法或基因枪直接接种带毒甘薯植株，接种15天后，剥取甘薯茎尖，利用茎尖组织培养技术获得脱除SPCSV的甘薯。(3)本专利技术针对甘薯上严重发生的SPCSV，成功构建了 SPCSV的RNAi载体，并将RNA干扰与茎尖组织培养相结合，建立了甘薯脱毒技术新体系，有效提高了脱除SPCSV的效率，培养成功的甘薯脱毒品种的产量得到有效提高。【附图说明】图1:目的片段RNase3的PCR扩增图。图中，M:DL2000分子量标记，I:RNase3 PCR扩增产物。图2:pR0KRNase3IR 经 &oRI 和历idIII 酶切验证图。图中，M:DL2000分子量标记；1:pR0KRNase3IR经^boRI和历《1111酶切的产物。图3:pBINRNase3IR 菌液 PCR 验证图。图中，M:DL2000 分子量标记；1，2:pBINRNase3IR 菌液 PCR 产物。【具体实施方式】实施例1:针对甘薯褪绿矮化病毒RNase3基因的干涉载体 1.材料与方法 (I)SPCSV的RNase3基因序列 利用RT-PCR方法从感病甘薯叶片中扩增出SPCSV的RNase3基因，RNase3基因长度为687bp，将其克隆至T载体上，命名为RNase3-T。基因全序列如下:I ATGATTCCGA TCTTTTCTGA TGTTTCTGAA GAAAGTAAAC TTACTATCTT CGGAAGTCGT61 CATAGATTGG ATTCTATCAT ACAATCCATT TGTACTTCAG AAGACAGAGA CAAATATGAA121 ATTTTGGGTG ATTGGGCTAT CACAACATAC GTTACTAGTA TGTTGACTGA TCTTTTTAAA181 CATGACGCAG ATGCCGAATC TCTGTCCTTA CTTCGTGCTC ATAATATTTC AAATTTTATG241 TTCGCGAAAG CTATGGTGGA GTCAAGATTT TATG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种针对甘薯褪绿矮化病毒的RNase3基因的干涉载体，其特征在于，构建方法包括以下步骤：（1）引物设计：根据甘薯褪绿矮化病毒RNase3基因的核苷酸序列设计两对引物，具体如下：RNase3‑KpnI‑5’：5'‑GCAGGTACCATGATTCCGATCTTTTCTGATG‑3'，RNase3‑XhoI‑3’：5'‑CGCCTCGAGTCAATTCAAATTTAGAGCTTCG‑3'；RNase3‑SacI‑5’：5'‑TGCGAGCTCATGATTCCGATCTTTTCTGATG‑3'，RNase3‑XbaI‑3’：5'‑CGGTCTAGATCAATTCAAATTTAGAGCTTCG‑3'；（2）甘薯褪绿矮化病毒RNA干涉载体的构建：利用PCR方法将甘薯褪绿矮化病毒的RNase3基因克隆到T载体上，命名为RNase3‑T，以RNase3‑T为模板，以RNase3‑KpnI‑5’和RNase3‑XhoI‑3’为引物，进行PCR扩增，将获得的目的基因RNase3用KpnI和XhoI双酶切后，将其克隆到pBlue NiRIntron载体内含子一侧的相应位点；采用相同方法，以RNase3‑T为模板，以RNase3‑SacI‑5’和RNase3‑XbaI‑3’为引物，进行PCR扩增，将获得的目的基因RNase3用SacI和XbaI双酶切后，将其克隆到pBlue NiRIntron载体内含子另一侧的相应位点，构建成含RNase3基因反向重复序列的载体，命名为pIntron‑RNase3IR；然后利用SacI和KpnI双酶切pIntron‑RNase3IR载体，回收含RNase3基因反向重复序列的目的片段RNase3IR，将该目的片段克隆到中间载体pROK219上，该片段位于35S启动子的下游、NOS终止子的上游，命名为pROKRNase3IR；用EcoRI和HindIII酶切pROKRNase3IR，回收包括35S启动子、RNase3基因反向重复序列和NOS终止子的目的片段35S‑RNase3IR‑NOS，将该目的片段克隆到植物表达载体pBIN19上，命名为pBINRNase3IR。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张振臣，秦艳红，田雨婷，王永江，张德胜，王爽，乔奇，
申请(专利权)人：河南省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41