一次性检测肺癌多重基因的引物、探针、检测体系和试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一次性检测肺癌多重基因的引物、探针、检测体系及试剂盒，其中包括用于检测肺癌EGFR基因18种突变、KRAS基因7种突变和BRAF V600E基因突变、ALK5种融合基因和ROS19种融合基因的引物、探针及其分配方式。本发明专利技术的检测试剂盒采用12联PCR反应条设计，每一个12联PCR条检测一个样品的多重基因，12联条的1-11管内装有相应的检测和内控试剂，突变由FAM信号指示，内控由HEX(或VIC)信号指示；12号管作为DNA提取质量的外控检测管，亦由FAM信号指示。本发明专利技术可以实现一次性检测肺癌EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1基因，大大缩短了检测的时间，灵敏度高，特异性强，操作简便快捷，可为临床医生对肺癌患者选择肿瘤靶向药物治疗提供参考。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体地涉及肺癌多重基因的引物、探针及检测体系。
技术介绍
肺癌是恶性肿瘤中发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌 (NSCLC)占肺癌的85%左右。我国是肺癌发病率最高的国家，每年约有60万人被确诊为肺 癌。在过去的30年里，肺癌的病死率增加了 464. 84%，据世界卫生组织（WHO)估计，截至 2025年，我国每年肺癌死亡病例将达到100万。目前化疗仍是肺癌最主要治疗手段，虽然 随着新一代化疗药物的出现，肺癌疗效有了一定程度的提高，但肺癌患者的总生存率仍然 较低，究其原因，主要是大多数肺癌由于缺乏高灵敏度的基因突变检测和确诊技术以及与 之相匹配的科学的治疗方案，从而失去了治疗的最佳时机。近年来，分子靶向治疗已经成 为肺癌研究热点，越来越多分子靶点的发现及靶向药物的研发给肺癌患者长期生存带来了 希望。随着肿瘤个体化治疗理念的提倡、分子检测技术的进步和靶向治疗药物的不断推出， 肺癌核酸标志物检测指导治疗方案引起了众多学者的关注和探讨，其研究热点主要集中于 EGFR、BRAF、KRAS、ALK、R0S1 等靶点。 目前，从法国报道的1000例的肺癌BM项目研究、美国LCMC项目等项目显示肺癌 分子靶点的多基因检测和筛查意义重大，有助临床实践和临床试验，能显著改善患者生存 质量。然而，目前大多每次只能检测一个突变或一段基因的突变，检测通量低，只能逐个筛 查，耗时长。同时，由于晚期患者取材较难，样本量较少，往往不能满足逐个筛查的需要，且 临床上尚无能够同时、一次性完成对此5个热点基因进行检测的试剂盒。 本专利技术提供一种高灵敏度和高特异性的用于一次性检测多重肺癌基因的引物、探 针、试剂盒及引物分配方式。该检测试剂盒利用DNA样本进行基因突变和RNA样本进行基 因融合的检测，特异性和灵敏度高，检测结果重复性好，而且引入了荧光检测技术，克服了 传统PCR产物遗留污染的问题，操作简便快捷，为临床EGFR、BRAF、KRAS、ALK和R0S1基因 突变/融合的检测提供了一种快速可靠的检测方法。该方法可以实现一次性检测肺癌的多 重基因，大大缩短了检测的时间，提高了肺癌基因检测的灵敏度和准确率，从而实现指导肺 癌临床治疗方案制定及化疗预后。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于一次性检测多重肺癌基因的引物、探针，包括EGFR、BRAF、KRAS、ALK和R0S1等热点基因的引物、探针及分配方式，其序列如表1 : 表1引物、探针以及序列号【主权项】1. 一次性检测肺癌多重基因的引物和探针，包括如下81条序列，且所述的序列分为12 组，具体如下：O2. -次性检测肺癌基因检测的反应体系，包括 ①融合基因其中，EARKB混合酶A的组成如下：其中，所述的引物和探针如权利要求1所示。3. 如权利要求2所述一次性检测肺癌基因检测的反应体系，其特征在于，加入的EARKB 混合酶A的组成为Hs-taq酶0. 28 ii L、UNG酶0. 02 ii L、逆转录酶0. 5 ii L ;EARKB混合酶B 的组成为 Hs-taq 酶 0? 25 ii L、UNG 酶 0? 05 ii L。4. 一种试剂盒，包括权利要求1所述的12组序列，这12组序列分别装入12联管内。【专利摘要】本专利技术公开了一次性检测肺癌多重基因的引物、探针、检测体系及试剂盒，其中包括用于检测肺癌EGFR基因18种突变、KRAS基因7种突变和BRAF V600E基因突变、ALK5种融合基因和ROS19种融合基因的引物、探针及其分配方式。本专利技术的检测试剂盒采用12联PCR反应条设计，每一个12联PCR条检测一个样品的多重基因，12联条的1-11管内装有相应的检测和内控试剂，突变由FAM信号指示，内控由HEX(或VIC)信号指示；12号管作为DNA提取质量的外控检测管，亦由FAM信号指示。本专利技术可以实现一次性检测肺癌EGFR/KRAS/BRAF/ALK/ROS1基因，大大缩短了检测的时间，灵敏度高，特异性强，操作简便快捷，可为临床医生对肺癌患者选择肿瘤靶向药物治疗提供参考。【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11【公开号】CN104818318【申请号】CN201410313324【专利技术人】黄蛤目, 林清华, 施伟杰, 江风阁, 宋庆涛, 阮力, 郑立谋 【申请人】厦门艾德生物医药科技有限公司【公开日】2015年8月5日【申请日】2014年7月2日本文档来自技高网...

【技术保护点】
一次性检测肺癌多重基因的引物和探针，包括如下81条序列，且所述的序列分为12组，具体如下：

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄蛤目，林清华，施伟杰，江风阁，宋庆涛，阮力，郑立谋，
申请(专利权)人：厦门艾德生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35