比沙可啶对中央记忆性T细胞体外扩增中的应用制造技术

本发明专利技术提供了比沙可啶对中央记忆性T细胞在体外扩增上的应用，所述比沙可啶的浓度为5~40uM，最适浓度为20uM，所述中央记忆性T细胞为CD4+ T细胞。本发明专利技术中首次公开了比沙可啶在体外T细胞培养中的应用，方法安全有效，成本低廉，为过继免疫治疗的广泛开展提供了良好的技术支持。

【技术实现步骤摘要】
比沙可啶对中央记忆性T细胞体外扩增中的应用
本专利技术属于中央记忆性T细胞体外扩增
，更具体地，涉及比沙可啶对中央记忆性T细胞体外扩增中的应用。
技术介绍
比沙可啶（英语：BISACODYL），是一种临床上通常用于缓解便秘，神经源性肠道功能障碍的管理以及诸如结肠镜检查等医学检查前的肠道清洁。比沙可啶刺激大肠神经末梢，引起肠反射性蠕动增加而导致排便。它也是一种接触性泻药，可抑制结肠内钠、氯及水分的吸收，使肠内容积增大，引起反射性排便。比沙可啶对小肠的作用可忽略不计；刺激性泻药主要作用于大肠。由于T细胞在免疫系统中起着重要的作用，越来越多的研究小组尝试运用T细胞的过继治疗的方式来进行肿瘤治疗。中央记忆性T细胞（TCM）具有自我更新的能力，而且应答时间短，作用时间长，对人体的副作用小。今年来，多个研究组报道，发现具有记忆功能的T细胞回输肿瘤患者体内以后，治疗效果明显并且持续治疗时间长，可以减少患者的痛苦以及降低细胞体外培养次数过多的生物安全风险。但是在人体内相对数量较少，且由于体外长时间培养的T细胞会使T细胞失去活力，绝大部分细胞分化为终末分化的效应细胞，使得回输体内的T细胞存活时间过短，无法产生持续的杀伤肿瘤细胞的功能，因此如何在体外获得大量的记忆性T细胞是细胞免疫治疗的一个新的研究热点。目前，国外的许多研究小组通过构建人工抗原提呈细胞，将其应用于T细胞的体外培养，提高T细胞的存活时间，用于过继免疫治疗，但要获得足够量的T细胞，技术要求复杂，培养的成功率较低。在进行T细胞治疗时，主要策略是先通过克隆扩增，得到足够量的具有杀伤功能的T细胞，可以与DC等提呈细胞共培养，也可以直接用相关肿瘤抗原刺激细胞克隆扩增，得到具有特定肿瘤抗原特异性的T细胞。此种办法培养得到的T细胞未经过任何转基因修饰，安全性较高。但这种肿瘤高反应性的细胞需要扩增至临床需要的109-1011治疗剂量的数量数，过程持续时间比较长，对于肿瘤患者来说时间也是一个需要更多考虑的因素。而且体外培养的时间长，细胞容易变老，活力下降，多为终末分化的细胞，在体外有较好的效果，但是在体内存活时间较短，治疗效果受影响。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有中央记忆性T细胞体外扩增技术的不足，提供比沙可啶对中央记忆性T细胞体外扩增中的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术提供了比沙可啶对中央记忆性T细胞在体外扩增上的应用。优选地，所述比沙可啶的浓度为5~40uM。更优选地，所述比沙可啶的浓度为20uM。优选地，所述中央记忆性T细胞为CD4+T细胞。优选地，所述中央记忆性T细胞的提取方法是先将外周成分血与含2%BSA和0.5%EDTA的PBS按1:4混合均匀；然后将稀释后的血液缓慢加入淋巴细胞分离液的上方，二者的比例为1:1；离心300×g30min；小心吸取单核细胞，置入另一离心管中，加入5倍体积的含0.5%BSA和2%EDTA的PBS稀释，混合均匀后，300×g15min；重复上一步骤一次；孵育CD4+T细胞阴选一抗，15min；用10倍体积的含0.5%BSA和2%EDTA的PBS稀释，混合均匀后，300×g12min；孵育带有磁珠的二抗，30min；过柱进行细胞分选，得到CD4+T细胞。优选地，所述中央记忆性T细胞的培养方法是在5%CO2、饱和湿度及37oC条件下将5×105个/孔的CD4+T细胞置于1mL含10%胎牛血清的RPMI1640中培养。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点及有益效果：本专利技术首次公开了比沙可啶在体外T细胞培养中的应用，方法安全有效，成本低廉，为过继免疫治疗的广泛开展提供了良好的技术支持。附图说明图1为比沙可啶浓度为20uM时对CD4+T细胞中CD4+TCM所占比例的检测。图2为不同浓度的比沙可啶对中央记忆性CD4+T细胞的比例扩增效果。具体实施方式以下结合具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本专利技术所用试剂和材料均为市购。实施例11、试验材料准备人的外周成分血由广州市血液中心提供，试验中随机选取了24份正常人的血液样本。主要试剂：胎牛血清购自于GIBCO公司；RPMI1640培养基购自于INVERTROGEN公司；比沙可啶购自于INVERTROGEN公司；流式细胞仪检测抗体anti-CD45RA-TexasRed、anti-CCR7-AF700\anti-CD62L-PE-cy7购自于BD公司；淋巴细胞分离液购自于天津灏阳生物制品有限责任公司；CD4+T细胞阴性选择磁珠购自于BD公司。主要的实验仪器：台式高速离心机（EppendorfCentrifuge5810R）、流式细胞仪（BeckmanCoulter公司）、CO2细胞培养箱（ThermoSCIENTIFIC）、生物安全柜（ThermoSCIENTIFIC）、倒置生物显微镜（Leica）、磁珠分选磁力架（BDPharmigen）。细胞培养2.1细胞提取分离将外周成分血与PBS缓冲液（含2%BSA、0.5%EDTA）按1:4混合均匀；然后将稀释后的血液缓慢加入淋巴细胞分离液的上方，二者的比例为1:1；离心300×g30min；小心吸取单核细胞，置入另一离心管中，加入5倍体积的PBS（含0.5%BSA、2%EDTA）稀释，混合均匀后，300×g15min；重复上一步骤一次；孵育CD4+T细胞阴选一抗，15min；10倍体积的PBS（含0.5%BSA、2%EDTA）稀释，混合均匀后，300×g12min；孵育带有磁珠的二抗，30min；过柱进行细胞分选，得到CD4+T细胞，加入含10%胎牛血清的RPMI1640重悬细胞，计数细胞后调整细胞至所需浓度。2.2培养条件在5%CO2、饱和湿度及37oC下，将5×105个/孔的CD4+T细胞置于1mL含10%胎牛血清的RPMI1640中培养。细胞铺板及加药处理3.1铺板将分选出来的CD4+T细胞铺在12孔板中，按照实验设计，每孔预期的细胞数为5×105。3.2加药处理对铺板后的CD4+T细胞进行5种不同的处理，每种处理设置三个复孔作为平行对照，并在细胞培养的第4天，第7天，第10天，第13天施加相应刺激。细胞亚群分析及细胞数量的检测细胞培养15天后，分别吸取不同供体（n=24）的培养孔中的细胞，用细胞计数仪进行计数；从相对应的培养孔中吸取5×105个细胞、300×g15min，用PBS洗涤细胞两次，孵育检测CD4+TCM的流式抗体（CD45RA、CCR7、CD62L）半个小时；洗掉流式抗体，加入PBS稀释到相应浓度，运用流式细胞仪检测。对照组与实验组均为同一供体的CD4+T细胞，每个时间点分别取不同供体的细胞进行检测。统计学软件及统计方法采用SPSS13.0分析软件进行统计学分析。计量资料所有结果均用均数±标准差表示。实验组与对照组比较采用t检验，P<0.01为有显著性差异。实验结果6.1比沙可啶对CD4+TCM在CD4+T细胞中所占比例的流式检测为了确定加入比沙可啶刺激的CD4+T细胞中TCM的起始比例，将CD4+Tcells以5×106个/孔铺于24孔板中，加入anti-CD3抗体、本文档来自技高网...

【技术保护点】
比沙可啶对中央记忆性T细胞在体外扩增上的应用。

【技术特征摘要】
1.比沙可啶对中央记忆性T细胞在体外扩增上的应用，所述中央记忆性T细胞为CD4+T细胞。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述比沙可啶的浓度为5~40μM。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述比沙可啶的浓度为20μM。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述中央记忆性T细胞的提取方法是先将外周成分血与含2%BSA和0.5%EDTA的PBS按1:4混合均匀；然后将稀释后的血液缓慢加入淋巴细胞分离液的上方，二者的比例为1:1；离心300×g30min；小心吸取单核细胞，置入另一离心管中...

【专利技术属性】
技术研发人员：张辉，张译文，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44