本发明专利技术公开了一种检测JAK2基因V617F位点多态性的引物、试剂盒及其PCR方法，其中包括：野生型特异性上游引物、突变型特异性上游引物和野生型特异性上游引物与突变型特异性上游引物共用的下游引物；且所述野生型特异性上游引物具有SEQ No.17序列，所述突变型特异性上游引物具有SEQ No.14序列，所述共用的下游引物具有SEQ No.16序列；试剂盒具有检测简单、快速、准确、廉价等优点，为科研和临床JAK2基因V617F位点分型和基因突变分析提供了强有力的工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学基因检测领域，特别提供了一种检测JAK2基因多态性的 引物、试剂盒及其PCR方法，用于JAK2基因V617F多态性位点的快速检测。
技术介绍
JAK是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶，迄今为止共发现有4个家族成员，分别为 JAK1、JAK2、JAK3和JAK4。STAT是JAK的直接底物，能将信号直接传递到核内，调节特定基 因的表达。JAK-STAT信号通路是与细胞生长、增殖、分化关系十分密切的一条信号通路，也 参与造血和免疫等系统的信号转导，而激酶JAK对整个信号通路激活起着关键作用。迄今 已在人类白血病细胞中发现多种JAK基因点突变，其中一些突变能导致STAT蛋白持续激 活。例如JAK2基因V617F突变可导致JAK-STAT信号通路的异常激活，导致骨髓细胞产生 异常增殖。 骨髓增殖性疾病（myeloproliferative diseases，MPD)是一组造血干细胞肿瘤增 生性疾病。在骨髓细胞普遍增生的基础上有一系或多系细胞尤其突出，呈持续不断的过度 增殖和外周血中成熟细胞数量增多为特征。其临床表现具有异质性，但各亚型几乎都伴有 白细胞、血小板及巨核细胞增多，后期出现骨髓纤维化和骨髓衰竭，随病程进展部分可转化 为其他疾病。其经典的分类主要分为慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia， CML)、真性红细胞增多症（polycythemia vera，PV)、原发性血小板增多症（essential Thrombocythemia，ET)以及原发性骨髓纤维化（primary myelofibrosis，PMF)等。 JAK2基因V617F多态性位点发生在65%~97%的真性红细胞增多症（PV)、23%~57% 的原发性血小板增多症（ET)及35%~57%的原发性骨髓纤维化（PMF)患者中。根据JAK2突 变与骨髓增生性疾病的密切关系，在修订的2008世界卫生组织（WHO)分类系统中，JAK2基 因V617F多态性位点成为慢性骨髓增殖性疾病（MPD)主要的诊断指标。 目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有直接测序法；基因芯片杂交法； PCR-RFLP方法；PCR扩增产物毛细管电泳分析法；PCR-SSCP;PCR高分辨熔解曲线分析技 术；PCR-TaqmanMGB(MinorGrooveBinder)探针法；AS-PCR法；Cast-PCR法等。这些方 法或多或少还存在仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床 普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等缺点。 如：1)直接测序法是突变分析的金标准，能发现已知和未知突变位点，但该法检测 基因突变的灵敏度为20%(即目的基因的突变基因DNA模板数占野生型DNA模板数的20%)。 同时还存在操作复杂，周期长，分析速度慢，常需要2天的时间，而且该法是开管操作，大大 增加污染的可能性，不适合对大规模标本的检测，同时还需要昂贵的仪器，存在在基层不易 实施等缺点。 2)普通PCR-RFLP方法技术简便，价格便宜，适宜少量样本的实验室检测，但RFLP 仅能检测有酶切位点的突变，无酶切位点不能检测，费时费力，还存在PCR产物污染导致 假阳性的风险，见。 3)芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用 于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。 4)PCR高分辨熔解曲线分析技术，能高通量检测基因的突变情况，试剂成本较低， 但因其荧光信号来自染料，特异性受到影响，而且检测仪器是升级版的荧光PCR仪，价格高 昂，普及受限，见〇 5)PCR-TaqmanMGB探针法适合已知突变位点，常常需要两条探针，而Taqman MGB探针的合成价格是普通Taqman探针的几倍，见，并且不能检测样本中的含量 较少（彡1，〇〇〇个中的1个）的等位基因或突变位点。 6)PCR-SSCP法虽然简单，但该法是开放性的检测系统，容易造成PCR产物的污染， 而且操作步骤多，费时费力。 7)等位基因特异性引物PCR扩增法（AS-PCR)，这一方法是目前检测基因突变或 多态性最简单快速的方法（WuDY,UgozzoliL,PalBK,WallaceRB.，ProcNatl AcadSciUSA1989; 86:2757-2760)，其原理是引物3'末端碱基与模板的碱基错配，其PCR 的效率将会下降 1〇3-1〇6.6倍（Chen,X.，andSullivan,PF,ThePharmacogeonomics Journal2003，3，77-96)。尽管该方法的原理简单，但错配的引物，依然会发生非特异 性扩增，扩增情况视突变的类型和检测位点周围的碱基序列相关（AyyadevaraS,Thaden JJ,ShmooklerReisRJ.,AnalBiochem2000; 284:11-18)，还与样本中存在的等位 基因变量的影响。为了增加AS-PCR的特异性，许多科学家做了很多努力。大量的实验证 明，该方法最关键的是设计与3'末端突变位点碱基互补或错配的两条特异引物，引物设 计不好，将导致高背景的交叉扩增，会导致较高的假阳性。尽管不少人努力将这一弊端克 月艮，如报道的TaqMAMA方法，在3'倒数第二位或第三位上引入突变碱基，的确可以增加反 应的特异性，但仍然无法完全消除假阳性，而且在纯合子与杂合子的判断上，缺乏标准， 会出现混乱的情况，见。简单的AS-PCR，通常采用PCR反应结束后再进行电泳，从有无反应 条带来判断结果，这种方法虽然不需要昂贵的仪器，但电泳操作，增加了PCR的污染机会， 而且耗时费力。尽管有人对该方法作了改进，采用荧光定量PCR技术，但得到的不是"全或 无"式的结果，总会有非特异性反应的发生，即同样的引物对野生型和突变型位点都会扩 增，只是其得到的Ct(Cyclethreshold)不同而已，因此就引入了ACt的概念，即ACt= 野生Ct-突变Ct，但计算复杂，如要ACt值大于纯合子Ct值判为突变型纯合子，ACt值 小于杂合子Ct值，判为杂合子，ACt值的引入不仅增加了操作步骤，还会引起混乱，因为 ACt值的设定标准无法准确定位，不同人员的操作、不同的标本和不同的检测仪器都会有 不同的数字，给临床应用带来很大的困难，实际应用依然受限，见〇 8)美国LIFE公司采用一种MGB封闭探针的方法，称作Cast-PCR(Competitive allelespecificTaqmanPCR)，用MGB探针将不检测的位点封闭，然后用等位基因特异 引物荧光定量PCR的方法检测目的位点，这虽然提高了检测的特异性，但由于多加入一 条MGB封闭探针，势必增加成本，对反应效率多少会带来干扰，见。有人采用锁 核酸（LNA) (PlantMethod2007, 3 :2)或修饰的碱基（AnalBiochem. 2005, 340 :287-294) 的PCR引物，可以使得AS-PCR检测灵敏度提高。然而，这些方法增加了分析的总体成本，并 需对反应进行深度优化。 因此，如何对JAK2基因V617F多态性位点进行简单准确的检测，成为人们亟待解 决的问题。
技术实现思路
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【技术保护点】
一种检测JAK2基因V617F位点多态性的引物，其特征在于，所述引物包括：野生型特异性上游引物、突变型特异性上游引物和野生型特异性上游引物与突变型特异性上游引物共用的下游引物；且所述野生型特异性上游引物具有SEQ No.17序列，所述突变型特异性上游引物具有SEQ No.14序列，所述共用的下游引物具有SEQ No.16序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高劲松，张英杰，李星颐，王莹，魏潇，魏奇，
申请(专利权)人：沈阳优吉诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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