一种中空开放明胶细胞微载体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种中空开放明胶细胞微载体及其制备方法和应用。首先以明胶和蜂蜡为原料，使用双乳法制备明胶蜂蜡微球，再在乙醇/水溶液中重塑，然后在戊二醛/乙醇溶液中交联，最后挤出明胶微球内部的蜂蜡小球，得到中空开放明胶微载体。本发明专利技术以蜂蜡作为致孔剂，利用双乳液法制备明胶微球，在乙醇/水加热处理并干燥后，明胶表面形成一层致密的壳层，加入戊二醛/乙醇溶液使其表面交联；微球干燥后用力挤压，明胶微球内部的蜂蜡小球受力，使表面的交联层破裂，得到具有中空开放壳层结构的明胶微载体；该微载体具有低密度、高比表面积的特点，为细胞大规模的培养提供了可能；具有优良的生物降解性和生物相容性，亦可用于组织工程中骨缺损的填充修复材料。

【技术实现步骤摘要】
一种中空开放明胶细胞微载体及其制备方法和应用
本专利技术属于组织工程的生物材料
更具体地，涉及一种中空开放明胶细胞微载体及其制备方法和应用。
技术介绍
组织工程和再生医学技术是一种新兴的组织器官再生与修复手段，是建立在化学、材料学、生命科学和工程学等基础上的交叉学科，经过二十余年快速发展，已继外科重建和器官移植后，第三种组织和器官缺损或功能衰竭的治疗手段。组织工程的三个关键因素分别是种子细胞的培养，组织支架的制备以及细胞支架复合体的形成，其中核心是细胞和生物材料所构成的细胞支架复合体。细胞微载体是近二十多年发展起来并得到广泛应用的细胞复合支架，既不改变细胞附着表面生长成单层的特性，又大大提高了培养表面积和容积之比，使细胞得到较大规模的培养。生物降解细胞微载体不仅可以作为细胞的高密度培养微载体，也可以作为组织工程中的可注射型细胞载体用于对组织和器官缺损的修复和再生。但是，以往研究的生物降解微载体均是微球状载体，在成骨细胞/微载体/水凝胶复合体系体内注射的实验当中表明，该体系输送细胞的效率相对不高，细胞仅能依附于载体表面单层生长，而复合体系中大多数空间被无细胞的载体或水凝胶所占据，不利于大量地高密度输送治疗细胞，为新生组织预留的空间也不足。虽然利用多孔的微球代替实心微球，可以部分解决这一问题，但由于这种材料要满足注射治疗的需要，因此需要这种多孔微球的内部网孔结构非常小，而这么小的网孔使得细胞很难进入微载体球体中心部位。因此，需要设计制备新型结构的细胞微载体，满足可注射组织修复的需要。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有生物降解微载体的缺陷和技术不足，提供一种即可满足可注射组织修复的需要，又具有很高的细胞输送效率，而且具有很好的生物相容性和生物可降解性的中空开放明胶细胞微载体。本专利技术另一目的是提供上述中空开放明胶细胞微载体的制备方法。本专利技术再一目的是提供上述中空开放明胶细胞微载体的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种中空开放明胶细胞微载体的制备方法，首先以明胶和蜂蜡为原料，使用双乳法制备明胶蜂蜡微球，再在乙醇/水溶液中重塑，然后在戊二醛/乙醇溶液中交联，最后挤出明胶微球内部的蜂蜡小球，得到中空开放明胶细胞微载体。具体地，上述制备方法包括如下步骤：S1.双乳法制备明胶蜂蜡微球S11.明胶水溶液加热至70～80℃，加入蜂蜡，搅拌5～10min，得到蜂蜡/明胶乳液；S12.将蜂蜡/明胶乳液倒入60℃预热好的食用油中，搅拌、乳化10～15min；然后倒入-20～4℃预冷的冰乙醇中，静置；S13.二氧六环/丙酮溶液反复清洗（除去食用油），干燥，得到明胶蜂蜡微球；S2.把明胶蜂蜡微球依次放进乙醇溶液、戊二醛溶液中进行重塑和交联；S3.最后对明胶蜂蜡微球进行挤压，去掉球内的蜂蜡，即得中空开放明胶细胞微载体。更具体地，上述制备方法的步骤如下：S1.双乳法制备明胶蜂蜡微球S11.配制1%（w/v）明胶水溶液，加热至70～80℃，在400～700rpm的搅拌下，加入蜂蜡，搅拌3～15分钟；明胶与蜂蜡的用量比为1：1～5；S12.将S11所得乳液倒入60℃预热的食用油中，在200～600转/分的转速下乳化5～30分钟；S13.将S12所得混合液倒入-20℃预冷的冰乙醇中，静置15～30分钟；S14.用二氧六环/丙酮溶液反复清洗，干燥，得到明胶蜂蜡微球（明胶蜂蜡微球的直径为200～400μm，适用于制备大小合适的微载体）；S2.重塑：将S1所得明胶蜂蜡微球置于70～85%乙醇/水溶液中，70℃重塑3～8分钟，干燥得到重塑后的明胶蜂蜡微球；S3.戊二醛交联：将重塑后的明胶蜂蜡微球放置在戊二醛/乙醇溶液中，4℃交联10～24h，乙醇反复清洗，真空干燥得到交联后明胶蜂蜡微球；S4.挤压去蜡：用力挤压交联后明胶蜂蜡微球，所有微球均被挤破后，浸泡在正己烷溶液中，过夜，乙醇清洗多次，干燥即得中空开放明胶微载体。其中，优选地，步骤S2的具体操作如下：S21.取明胶蜂蜡微球置于细胞培养板（如24孔板）中，细胞培养板在桌面上轻轻敲打，使微球颗粒紧密堆积，表面平整；S22.用注射器将85%的乙醇溶液注射入微球中，明胶蜂蜡微球和乙醇的用量比为1g/mL；S23.将细胞培养板移至70℃烘干5～8min，取出细胞培养板，以滤纸轻压明胶蜂蜡微粒表面，使粒子之间紧密粘连，并吸走多余的乙醇溶液；S24.把细胞培养板放置在-20℃冷冻20min后取出，并真空干燥，得到重塑后的明胶蜂蜡微球（明胶微球重塑的时间以轻轻碰触，表面刚粘连成片为准）。优选地，步骤S3所述戊二醛/乙醇溶液中戊二醛：乙醇=5：95（即5%的戊二醛溶液）。优选地，步骤S4具体是将交联后明胶蜂蜡微球均匀铺张在锡箔纸上，用研磨棒均匀用力挤压，观察所有微球均被挤破后，放置于正己烷溶液中浸泡过夜，无水乙醇清洗三次，干燥即得中空开放明胶微载体。优选地，S12所述食用油的用量按照水油相比为1：5进行。优选地，S12所述食用油为花生油。按照上述制备方法制备得到的中空开放明胶细胞微载体及其应用也在本专利技术的保护范围之内。所述制备得到的中空开放明胶细胞微载体可应用于细胞培养，尤其是细胞大规模培养，还可应用于组织工程中骨缺损的填充修复材料。本专利技术首次利用蜂蜡作为致孔剂，利用双乳液法制备明胶微球，并通过大量的研究和探索，制备出了一种中空开放的明胶细胞微载体。本专利技术采用的技术、表征手段及应用方式包括明胶蜂蜡微球制备、明胶蜂蜡微球重塑、中空开放明胶微载体制备、倒置荧光显微镜和扫描电子显微镜观察、中空开放明胶微载体表面细胞修饰和评价及体内修复胫骨缺损实验。为验证技术的有效性，本专利技术主要采用以下方法进行检测：1）倒置荧光显微镜观察制备中空开放明胶微载体过程中载体形状变化情况；2）扫描电子显微镜监测中空开放明胶微载体制备情况；3）层层自组装法提高中空开放明胶微载体表面生物相容性；4）把P4代骨髓间充质干细胞接种在灭菌后的中空开放明胶微载体上，培养5天后，进行死活细胞染色；5）把接种细胞后的微载体填充在兔胫骨缺损部位，修复一个月后，取胫骨进行苏木精/伊红染色，评价中空开放明胶细胞微载体修复骨缺损的能力。具体分析步骤如下：（1）通过倒置荧光显微镜观察明胶蜂蜡重塑前后及中空开放明胶微载体的外观；（2）通过扫描电子显微镜观察明胶微球重塑前后、交联后及中空开放明胶微载体的形貌，判断最终制备的微载体是否具备中空开放壳层结构；（3）通过层层自组装技术，在中空开放明胶微载体表面接上生物大分子（胶原、生长因子、肝素及酪蛋白），使其获得适宜于成骨再生的材料界面；（4）Dead/Live荧光染色分析骨髓间充质干细胞在中空开放明胶微载体的生长情况；（5）对填充细胞微载体一个月后的胫骨进行HE染色，检测缺损位置新生组织生长情况，从而分析中空开放明胶细胞微载体在组织工程骨缺损的填充修复材料中的应用前景。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术首次使用蜂蜡作为致孔剂，利用双乳液法制备明胶微球，在乙醇/水加热环境下处理一定时间后，进行干燥，是明胶表面形成一层致密的壳层，加入一定浓度的戊二醛/乙醇溶液使其表面交联。微球干燥后，用力挤压，明胶微球内部的蜂蜡小球受力，使表面的交联层破裂，从而得到具有中空开放壳层结构的明胶微载体，可以用于所以贴本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中空开放明胶细胞微载体的制备方法，其特征在于，首先以明胶和蜂蜡为原料，使用双乳法制备明胶蜂蜡微球，再在乙醇/水溶液中重塑，然后在戊二醛/乙醇溶液中交联，最后挤出明胶微球内部的蜂蜡小球，得到中空开放明胶细胞微载体。

【技术特征摘要】
1.一种中空开放明胶细胞微载体的制备方法，其特征在于，首先以明胶和蜂蜡为原料，使用双乳法制备明胶蜂蜡微球，再在乙醇的水溶液中重塑，然后在戊二醛的乙醇溶液中交联，最后挤出明胶微球内部的蜂蜡小球，得到中空开放明胶细胞微载体。2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.双乳法制备明胶蜂蜡微球S11.明胶水溶液加热至70～80℃，加入蜂蜡，搅拌5～10min，得到蜂蜡/明胶乳液；S12.将蜂蜡/明胶乳液倒入60℃预热好的食用油中，搅拌、乳化10～15min；然后倒入-20～4℃预冷的冰乙醇中，静置；S13.二氧六环的丙酮溶液反复清洗，干燥，得到明胶蜂蜡微球；S2.把明胶蜂蜡微球依次放进乙醇的水溶液、戊二醛的乙醇溶液中进行重塑和交联；S3.最后对明胶蜂蜡微球进行挤压，去掉球内的蜂蜡，即得中空开放明胶细胞微载体。3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤如下：S1.双乳法制备明胶蜂蜡微球S11.配制1%（w/v）明胶水溶液，加热至70～80℃，在400～700rpm的搅拌下，加入蜂蜡，搅拌3～15分钟；明胶与蜂蜡的用量比为1：1～5；S12.将S11所得乳液倒入60℃预热的食用油中，在200～600转/分的转速下乳化5～30分钟；S13.将S12所得混合液倒入-20℃预冷的冰乙醇中，静置15～30分钟；S14.用二氧六环的丙酮溶液反复清洗，干燥，得到明胶蜂蜡微球；S2.重塑：将S1所得明胶蜂蜡微球置于70～85%乙醇的水溶液中，70℃重塑3～8分钟，干燥得到重塑后的明胶蜂蜡微球；S3.戊二醛交联：将重塑后的明胶蜂蜡微球放置...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚逸鸿，庄良婷，曹智楠，唐颖，舒曼，李裕民，李燕，蒋庆，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44