提供稳定且容易地生产高感染滴度的细小病毒的方法。通过在培养上清中生产108TCID50/mL以上的高感染滴度的细小病毒的方法从而解决上述问题，所述方法包括以下工序：向包含宿主细胞和培养基的培养基材以感染复数成为0.0001～0.1的方式接种细小病毒的种病毒，所述宿主细胞的细胞密度为汇合增殖时的细胞密度的1/500～1/20，以宿主细胞的倍增时间的5～11倍的时间进行培养，对于培养上清进行回收。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在培养上清中生产高感染滴度的细小病毒的方法以及通过该方法得 到的高感染滴度的细小病毒溶液。
技术介绍
病毒在包括人在内的众多动植物、微生物中感染并扩增。某些病毒是具有DNA作 为基因组的DNA病毒，另外某些病毒是具有RNA作为基因组的RNA病毒，各病毒分别具有不 同的增殖机理。人等动物感染时，引起病毒感染症的病毒也很多。病毒不能单独增加，却能 够感染其他的动物?植物?微生物的细胞，利用该细胞的能力而增加。将病毒能够感染并 增殖的细胞称为该病毒的"宿主细胞"。病毒能够感染·增殖的宿主细胞的种类根据病毒的 种类而决定。 细小病毒为小型的单链DNA病毒，为直径小至约20nm的正20面体病毒，且不具有 被膜（非专利文献1)。细小病毒感染动物而引起疾病。作为该疾病，已知有：B19细小病 毒对人引起的传染性红斑、贫血、关节炎，除此之外还有由猴细小病毒（SPV)导致的贫血、 由猫细小病毒（FPV)导致的猫的肠炎?白血球减少?失调症、由犬细小病毒（CPV)导致的 犬的肠炎?心肌炎、由猪细小病毒（PPV)导致猪的死胎、由牛细小病毒（BPV)导致的牛的肠 炎、由鹅细小病毒（GPV)导致的鹅的肠炎·心肌炎、由小鼠微小病毒（MVM)导致的小鼠的肠 炎·肝炎等（非专利文献2、非专利文献3)。细小病毒作为引起犬、猫这样的人类饲养的动 物的生病的原因的病原体，是重要的。已知，如果犬感染犬细小病毒，则如前述那样引起肠 炎，产生激烈的痢疾、呕吐，甚至死亡（非专利文献3)。如果猫感染了细小病毒，则有时会 引起急性肠炎、白血球减少，在二次感染时也会有死亡的可能性；另外，如果胎儿、新生儿感 染，则中枢神经、胸腺受到损害，引起运动失调，有时也会死亡。 为了防止细小病毒感染症，关于细小病毒的疫苗进行了研宄（专利文献1、专利文 献2)。这些研宄中，需要生产病毒而使用。多数的病毒可以通过培养宿主细胞，使其感染病 毒而增殖，从而进行生产。使病毒弱毒化或非活化的疫苗生产也按照与病毒生产同样的步 骤而实现。 在制药行业中，为了保证基因重组药品（生物药品）、抗体药品等来源于生物的药 品不被病毒污染（病毒安全性），需要对于制造工序的病毒清除（去除性能）进行评价。 因此，通过向各工序前的药品中间产品中添加病毒并且对工序前后的病毒量进行定量，从 而能够对各个工序所具有的病毒清除进行测定。特别是，对于生物制剂的制造工序的病毒 清除评价中所使用的病毒种类的选择方法，用规定的ICHdnternational Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use :日美EU医药品法规协调国际会议）指导方针所记载的方法实施的血浆分级制 剂的病毒清除评价中，细小病毒的一种猪细小病毒（PPV:Porcine Parvovirus)被高频地 使用，生物药品的病毒清除评价中，细小病毒的一种小鼠微小病毒（MVM !Minute virus of mice)被高频地使用。这样，在生物制剂的制造工序的病毒清除评价中，高频地使用细小病 毒。 为了生产病毒，有：使用实验动物的方法、使用鸡蛋的方法、使用组织培养?培养 细胞的方法（非专利文献4)。使用实验动物、鸡蛋的方法存在成本高的缺点。代替其的方 法有使用培养细胞的方法（非专利文献5)。细小病毒的生产也通过使用培养细胞的方法进 行（专利文献1)。 为了生产细小病毒等病毒，通常进行使宿主细胞的培养体系感染种病毒，使病毒 增殖而进行回收的方法。此处所说的种病毒是指将病毒增殖初始所使用的少量的病毒视为 "种"的称呼。现有的病毒生产中，使宿主细胞感染种病毒的时机通常是宿主细胞达到汇合 且形成为单层状态的阶段（非专利文献4、专利文献3~6)。即，通常在将宿主细胞接种至 培养容器，使之增殖，从而在培养容器底面的整面宿主细胞增殖并铺满的状态下接种种病 毒，这是因为能够感染的细胞高密度地存在的状况，是提供生产更多病毒的场所的体系。从 将宿主细胞接种至培养容器起至其到达该汇合的状态为止，通常需要2~3天（非专利文 献4)。该汇合状态下，宿主细胞为稳定期，不再增殖。因此，现有技术在完成宿主细胞的增 殖培养工序之后，在不再引起细胞增殖的培养环境下开始病毒感染，与宿主细胞由于病毒 感染而死亡同时进行从而在培养上清中生产病毒。这样的方法中，用使细小病毒没有例外 地感染汇合状态的细胞的方法进行病毒生产（非专利文献6,非专利文献7)，得到的细小病 毒的感染滴度为IO 5~10 7TCID5(l/mL。在现有的培养体系中，在细胞数最多的状态即汇合的 状态下，向宿主细胞中添加细小病毒，添加的细小病毒在宿主细胞内增殖并伴随着宿主细 胞的死亡而增加。通过在细小病毒感染滴度变得最高的时期对培养上清进行回收，能够对 最高感染滴度的细小病毒溶液进行回收。用该方法在培养上清中得到的细小病毒，当然以 悬浮在供于细胞培养的培养基中的状态被回收。 另外，对于如上述得到的细小病毒溶液，也进行去除杂质。作为去除方法，通过低 速离心分离从而去除细胞的碎片等杂质而进行。另外，作为进一步去除杂质的方法，还已知 有使用了超离心分离技术的、氯化铯密度梯度超离心分离、蔗糖密度梯度超离心分离技术 (非专利文献8)。 现有技术文献 专利文献 专利文献I :W02007/125605号公报 专利文献2 :日本特表平10-508485号公报 专利文献3 :日本特开2009-297036号公报 专利文献4 :日本专利第2655876号公报 专利文献5 :日本特开昭58-22008号公报 专利文献6 :日本特开昭61-24370号公报 非专利文献 非专利文献1 :病毒?细菌感染新文件1997永井美之?渡边治雄编、羊土社： P. 68 少只?細菌感染new 7 7 <少1997永井美之?渡邊治雄編、羊土社：P. 68) 非专利文献2:病毒学1997畑中正一编、朝仓书店：222-223(少只学1997畑 中正一編、朝倉書店：222-223) 非专利文献 3:M. Azetaka et.al 1980Jpn.J. Vet. Sci. 43:243-255 非专利文献4:病毒实验学总论国立预防卫生研宄所学友会编1973 :61-180(夕彳 少只実験学総論国立予防衛生研宄所学友会編1973 :61-180) 非专利文献 5:Gregersen, J. P. Pharmazeutische Biotechnologie, Kayser 和 Muller(编）2000257-281 非专利文献 6 :P. A. Bachmann 1972Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (140) 4:1369-1374 非专利文献 7:Ρ· A. Bachmann et al. 1976Zbl. Vet. Med. Β· No. 23:355-363 非专利文献8:病毒实验学各论1973国立预防卫生研宄所学友会?编22-23(々 彳少只実験学各論1973国立予防衛生研宄所学友会?編22-23)
技术实现思路
专利技术要解决的问题 如本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高感染滴度的细小病毒的生产方法，其为通过在培养基材中培养宿主细胞和细小病毒的种病毒，从而在培养上清中生产108TCID50/mL以上的高感染滴度的细小病毒的方法，其包括：工序(a)，事先分别算出所述培养中的宿主细胞的对数增殖期的倍增时间和汇合增殖时的宿主细胞的细胞密度；工序(b)，向包含宿主细胞和培养基的所述培养基材以感染复数即MOI成为0.0001～0.1的方式接种细小病毒的种病毒，所述宿主细胞的细胞密度为工序(a)中事先算出的汇合增殖时的宿主细胞的细胞密度的1/500～1/20；工序(c)，对于工序(b)的包含宿主细胞和细小病毒的培养物以工序(a)中事先算出的倍增时间的5～11倍的时间进行培养；和工序(d)，对于包含通过工序(c)的培养而得到的细小病毒的培养上清进行回收。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳田恒一郎，
申请(专利权)人：旭化成医疗株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP
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