一种用于监测血管重构现象的方法与试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种用于监测血管重构现象的方法，以及涉及相应的用于监测血管重构现象的试剂盒。本发明专利技术所述方法是将体外培养的血管平滑肌细胞进行因素处理而制备成细胞爬片；或者将血管组织制备成石蜡切片；用稀释的细胞核增殖抗原Ki67覆盖，染色，荧光显微镜观察。本发明专利技术突破了传统上对于血管重构现象只监视细胞增殖或者只监视细胞凋亡的方法，首次提出了一种新的用于监控血管重构现象的方法，同时对细胞增殖和细胞凋亡进行观察，能够更有效地对移植血管的病理生理变化进行干预研究。本发明专利技术所述试剂盒特异性高，适用于基础与临床研究中体外培养细胞爬片、细胞涂片和各类组织切片中的组织细胞同时出现细胞增殖、凋亡以及静息情况研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于监测血管重构现象的方法，以及涉及相应的用于监测血管重 构现象的试剂盒。
技术介绍
冠脉血管架桥是将病人自体静脉移植到冠状动脉替代原有病变的动脉血管的一 种常见外科手术方法，是目前临床治疗因冠脉粥样硬化导致心肌梗死最重要手段之一。由 于移植血管在一年内有15%、3~5年内有30%、5~10年内有50%的移植血管出现重阻 塞，导致移植手术最终失败，给家庭、给社会以及经济造成很到损失。人们对于如何防止移 植后血管重阻塞的机制迄今仍不清楚。 目前，人们普遍认为，移植血管组织重构主要是由于血管平滑肌细胞的增殖过多、 死亡过少而形成，因而人们对移植血管的病理生理变化的干预研宄要么只是监视细胞增殖 及相应机制，要么只是观察血管组织的细胞死亡及机制。
技术实现思路
本专利技术突破了传统上对于血管重构现象只监视细胞增殖或者只监视细胞凋亡的 方法，首次提出了一种新的用于监控血管重构现象的方法，同时对细胞增殖和细胞凋亡进 行观察，能够更有效地对移植血管的病理生理变化进行干预研宄。 本专利技术所述的用于监测血管重构现象的方法是基于专利技术人的最新研宄成果，即血 管重构（包括移植静脉动脉化以及移植静脉粥样硬化过程）并不只是过去人们认识的细胞 过度增生而细胞凋亡抑制，而是细胞大量增生的同时，细胞凋亡也大量出现。本专利技术的实验 结果表明：一部分细胞（原来存在于血管壁上的干细胞或成纤维细胞）接受外来刺激后立 马开始分化和增生，继而开始合成大量的细胞外基质，分布到细胞外的血管膜上，使得血管 壁快速增加变厚，以快速抗衡和适应外来压力对管壁的伤害。与此同时，原有的血管壁上的 成熟的平滑肌细胞在突发外来伤害因素（如高血压产生的机械牵张力以及糖尿病高血糖 产生的AGEs等）作用下，细胞出现损伤进而通过凋亡的形式而被清除。在通过凋亡清理完 第一批受损伤细胞后，新生的细胞在经历了大量细胞外基质合成后亦会变得衰老，最终也 会通过凋亡的形式而被清除。只要外来伤害因子持续存在，血管的细胞（干细胞等）会不 断被激活而出现细胞的增殖和合成细胞外基质，血管也随之变厚，同时完成了功能的细胞 亦会衰老并经由凋亡途径而被清除。如此出现了血管中既可见有细胞大量增殖，亦可见其 它细胞出现大量凋亡。因而，细胞增殖越多，细胞调亡也就越多，最终血管重构速度也就越 快。由此建立本专利技术所述的用于监测血管重构现象的方法，通过对细胞增殖和凋亡同时原 位三重检测（增殖细胞、凋亡细胞和静息细胞）来更有效和更准确的监测血管重构现象。 根据本专利技术的一个【具体实施方式】所述的用于监测血管重构现象的方法，包括以下 步骤： A.体外培养的血管平滑肌细胞进行因素处理而制备成细胞爬片； B.用清洗液清洗，加入固定液覆盖染色标本，置于_20°C固定10分钟； C.用清洗液清洗，加入脱膜液覆盖染色标本，20_25°C孵育10分钟； D.用清洗液清洗，加入封闭液覆盖染色标本，置于湿盒中孵育30分钟； E.用含1 % BSA的PBS缓冲液稀释细胞核增殖抗原Ki67,稀释浓度为1 :200,将稀 释好的液体覆盖染色标本，置于湿盒中4°C孵育过夜； F.用清洗液清洗，加入Cy3标记荧光二抗，参考稀释浓度为1 :200,置于湿盒内室 温孵育2小时； G.用清洗液清洗，加入预先配制的体积比为1 :9的凋亡酶试剂和凋亡标记试剂， 20-25 °C保持1小时； H.用稀释浓度为I :200的细胞核复染试剂进行复染，20-25°C染色10分钟，用清 洗液清洗； I.甘油封片，焚光显微镜观察。 根据本专利技术的另一个【具体实施方式】所述的用于监测血管重构现象的方法，包括以 下步骤： A.将血管组织制备成石蜡切片； B.石蜡切片于60°C烤片2小时，依次置于二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、75%乙 醇、50%乙醇和去离子水中各3分钟； C.用清洗液清洗，加入固定液覆盖染色标本，置于湿盒内孵育30分钟； D.用清洗液清洗，加入封闭液覆盖染色标本，置于湿盒中孵育2小时； E.使用含1 % BSA的TBS缓冲液稀释细胞核增殖抗原Ki67,稀释浓度为1 :200,将 稀释好的液体覆盖染色标本，置于湿盒中4°C孵育过夜； F.用清洗液清洗，加入Cy3标记荧光二抗，参考稀释浓度为1 :200,置于湿盒内 20-25°C孵育2小时； G.用清洗液清洗，加入预先配制的体积比为1 :9的凋亡酶试剂和凋亡标记试剂， 20-25 °C保持1小时； H.用稀释浓度为I :200的细胞核复染试剂进行复染，20-25°C染色10分钟，用清 洗液清洗； I.甘油封片，焚光显微镜观察。 根据本专利技术所述的用于监测血管重构现象的方法的进一步特征，所述清洗液是 PBS缓冲液。 根据本专利技术所述的用于监测血管重构现象的方法的进一步特征，在各步骤中用清 洗液清洗时，至少清洗3次，每次清洗5分钟。 根据本专利技术所述的用于监测血管重构现象的方法的进一步特征，所述固定液是甲 醇，在使用前置于-20 °C预冷。 根据本专利技术所述的用于监测血管重构现象的方法的进一步特征，所述脱膜液是含 有 0· 25% Triton X-100 的 PBS 缓冲液。 根据本专利技术所述的用于监测血管重构现象的方法的进一步特征，所述封闭液是 5% BSA0 根据本专利技术所述的用于监测血管重构现象的方法的进一步特征，所述凋亡酶试剂 是末端脱氧核苷酸转移酶，所述凋亡标记试剂是核苷酸混合物。 根据本专利技术所述的用于监测血管重构现象的方法的进一步特征，所述细胞核复染 试剂为 DAPI，即 4'，6-二脒基 _2_ 苯基吲噪（4'，6-diamidino_2-phenylindole)。 本专利技术的另一目的是提供一种用于监测血管重构现象的试剂盒。 本专利技术所述的用于监测血管重构现象的试剂盒，包括：清洗液，为PBS缓冲液；固 定液，为甲醇；脱膜液，为含有〇. 25% Triton X-100的PBS缓冲液；封闭液，为5% BSA ;抗 体：Ki67 -抗，Cy3标记荧光二抗；抗体稀释液：含1 % BSA的PBS缓冲液；含1 % BSA的TBS 缓冲液；凋亡酶试剂，为末端脱氧核苷酸转移酶；凋亡标记试剂，为核苷酸混合物；细胞核 复染试剂，为DAPI。 目前用于监测血管重构现象的试剂盒只有以下两种：（1)检测细胞增殖的；（2)检 测细胞凋亡的。本专利技术所述的试剂盒不同于现有的两种试剂盒，它能同时检测细胞增殖、细 胞凋亡以及静息状态细胞，对增殖细胞、凋亡细胞和静息细胞进行原位三重检测。 本专利技术所述的试剂盒的应用范围包括：血管重构的调控，包括冠脉架桥后移植血 管的病理生理变化以及诱导向动脉化的检测与观察。静脉移植到冠状动脉后在动脉压力作 用下发生结构和功能的变化，在此过程中，血管壁的细胞会出现细胞大量增殖，并合成细胞 外基质大量积存于管壁，于此同时，施行功能后的细胞继而大量凋亡。并且细胞增殖得越 多，凋亡也就越多，结果是移植血管粥样硬化越快。本试剂盒可以检测到上述管壁细胞的变 化，可同时显示增殖细胞、凋亡细胞以及静息细胞。 本专利技术所述的方法与试剂盒的检测原理是：细胞或组织在体内代谢产物的刺激作 用下，会同时发生细胞增殖和凋亡，如果增殖信号强于凋亡信号，细胞向增殖通路发展，相 反，则细胞凋亡，组织内的细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于监测血管重构现象的方法，包括以下步骤：A.体外培养的血管平滑肌细胞进行因素处理而制备成细胞爬片；B.用清洗液清洗，加入固定液覆盖染色标本，置于‑20℃固定10分钟；C.用清洗液清洗，加入脱膜液覆盖染色标本，20‑25℃孵育10分钟；D.用清洗液清洗，加入封闭液覆盖染色标本，置于湿盒中孵育30分钟；E.用含1％BSA的PBS缓冲液稀释细胞核增殖抗原Ki67，稀释浓度为1：200，将稀释好的液体覆盖染色标本，置于湿盒中4℃孵育过夜；F.用清洗液清洗，加入Cy3标记荧光二抗，参考稀释浓度为1：200，置于湿盒内室温孵育2小时；G.用清洗液清洗，加入预先配制的体积比为1：9的凋亡酶试剂和凋亡标记试剂，20‑25℃保持1小时；H.用稀释浓度为1：200的细胞核复染试剂进行复染，20‑25℃染色10分钟，用清洗液清洗；I.甘油封片，荧光显微镜观察。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李朝红，平苏宁，李宇煌，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44