本发明专利技术公开了一种早期矽肺患者血清外泌小体miRNAs检测试剂盒，该试剂盒包括：血清分装管，外泌小体miRNAs提取试剂盒，外参线虫miR39试剂，逆转录试剂盒，hsa-U6引物，cel-miR-39引物，miRNAs引物试剂盒，qPCR检测试剂盒，无RNA酶的EP管，无水乙醇和ddH2O，miRNAs引物试剂盒包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示引物。利用试剂盒可快速高效地检测到矽肺病人血清中的外泌小体microRNAs，为检测筛选疑似早期矽肺患者提供了技术保证。
【技术实现步骤摘要】
早期矽肺患者血清外泌小体miRNAs检测试剂盒
本专利技术涉及一种职业病检测筛查试剂盒，特别是涉及一种早期矽肺患者血清外泌小体miRNAs检测试剂盒。
技术介绍
尘肺病是我国主要的职业病之一，约占职业病总人数的80％。我国矽肺病例占总病例50％，位居第一，是尘肺中危害最严重的一种。目前，矽肺的诊断标准主要依靠影像学，往往在病人出现明显症状时才能诊断出患有矽肺，这时任何药物都无法逆转已发生的肺纤维化病变。因此，寻找快速简便的矽肺早期生物标志物，开展二级预防显得十分必要。生物标志物的选择条件是快速、简便和稳定，人体外周血血清非常容易获取，血清中外泌小体表达水平不随温度、酸碱性、时间而快速变化。外泌小体是由细胞内多泡体与细胞膜融合后,释放到细胞外基质中的一种直径约30～120nm的膜性囊泡，这些膜性外泌小体在细胞之间穿梭传递重要信息，也会进入血液、唾液、尿液及乳汁等体液中，产生远程调控作用，实验证明，B细胞来源的外泌小体通过整合可与细胞外基质中的胶原-Ⅰ和纤维结合蛋白相结合，表明体内分泌的外泌小体经与细胞外基质相互连接，减少外泌小体的扩散，增加局部浓度，从而提高了外泌小体在局部的生理作用。外泌小体内包含有大量的特定miRNAs和特定蛋白质，带有大量的特定信息在细胞之间来回传递，因此认为选用血清中的外泌小体miRNAs作为生物标志物是可行的。外泌小体的提取一般采取超速离心或化学提取法，超速离心法存在提取费时(需48小时)费力和超离设备条件过高，并且由于过高的转速对操作者的安全构成威胁。单纯化学试剂提取法存在得率偏低等缺陷。miRNAs是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20～25个核苷酸，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNAs，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNAs或者阻遏靶mRNAs的翻译。最近的研究表明miRNAs参与到矽肺发生发展的各个过程，并且已经研究发现了一些特定的miRNAs调控矽肺纤维化的发病机制，比如miR-155、miR-29a。目前，qPCR技术已经成功应用于多种疾病的miRNAs检测，但尚未见该方法在矽肺病人血清中的外泌小体miRNAs检测方面的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术中的不足，提供一种早期矽肺患者血清外泌小体miRNAs检测试剂盒。本专利技术的技术方案概述如下：早期矽肺患者血清外泌小体miRNAs检测试剂盒，包括：血清分装管，外泌小体miRNAs提取试剂盒，外参线虫miR39试剂，逆转录试剂盒，hsa-U6引物，cel-miR-39引物，miRNAs引物试剂盒，qPCR检测试剂盒，无RNA酶的EP管，无水乙醇和ddH2O，所述miRNAs引物试剂盒包括SEQIDNO.1所示的miR-16-5p上游引物和SEQIDNO.2所示的let-7d-5p上游引物。本专利技术的优点：1)本专利技术的方法可使血清外泌小体的miRNAs提取得率高。梯度离心结合化学试剂提取法可以定量地从体液中提取外泌小体，减少了超高速离心法的危险性和化学法提取得率偏低的风险，为获得外泌小体中的miRNAs带来便利；2)选用的miRNAs在外泌小体中均为高表达。miR-16-5p、let-7d-5p在血清外泌小体中的表达相对较高，避免了极低表达量难以检测的缺陷。3)使用本专利技术的试剂盒鉴定疑似早期矽肺患者具有快速、高效、简便的特点。扩增效率高，灵敏度、特异性高，整个检测反应只需6小时即可完成，操作安全。本专利技术的方法、体系可以快速高效地检测到矽肺病人血清中的外泌小体microRNAs，为检测筛选疑似早期矽肺患者提供了新的技术平台，易于推广应用，具有较大的经济、社会效益。附图说明图1为早期矽肺患者血清外泌小体miR-16-5p的qPCR溶解曲线。图2为早期矽肺患者血清外泌小体miR-16-5p的qPCR扩增曲线。图3为早期矽肺患者血清外泌小体let-7d-5p的qPCR溶解曲线。图4为早期矽肺患者血清外泌小体let-7d-5p的qPCR扩增曲线。图5为早期矽肺患者血清外泌小体U6的qPCR扩增曲线。图6为早期矽肺患者血清外泌小体U6的qPCR溶解曲线。图7为早期矽肺患者血清外泌小体线虫miR39的qPCR扩增曲线。图8为早期矽肺患者血清外泌小体线虫miR39的qPCR溶解曲线。图9为早期矽肺患者血清外泌小体miR-155-5p的qPCR扩增曲线。图10为早期矽肺患者血清外泌小体miR-155-5p的qPCR溶解曲线。图11为早期矽肺患者血清外泌小体miRNAs诊断ROC曲线。图12let7d-5pΔCT值判定早期矽肺的概率。图13miR16的ΔCT值判定早期矽肺的概率。图14let7d-5p和miR16的ΔCT值判定早期矽肺的概率。具体实施方式下述试剂均为商品，其厂商为：1.5ml血清分装管，购自购自美国Axygen公司；外泌小体miRNAs提取试剂盒，内含ExoQuick、LysisBuffer、WashBuffer、ElutionBuffer、SeraMirRNAColumns，均购自美国SBI(SystemBiosciences)公司；外参线虫miR39试剂，购自天根生化科技(北京)有限公司，货号CR100-01；逆转录试剂盒，内含miRNARTEnzymeMix、2×TSmiRNAReactionMix,均购自北京全式金生物技术有限公司；hsa-U6引物,购自天根生化科技(北京)有限公司，货号CD201-0145；cel-miR-39引物,购自天根生化科技(北京)有限公司，货号CD200-01；miRNAs引物试剂盒,内含miR-16-5p上游引物；、let-7d-5p上游引物；qPCR检测试剂盒,内含UniversalmiRNAqPCRPrimer(10uM)、TopGreenqPCRSuperMix、PassiveReferenceDye(50×)(Optional)，均购自北京全式金生物技术有限公司；无RNA酶的EP管，购自美国GEB(GeneEraBiotech)公司；无水乙醇，购自天津市江天化工技术有限公司；ddH2O，购自北京全式金生物技术有限公司。下面通过具体实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1一种早期矽肺患者血清外泌小体miRNAs检测试剂盒，包括：1.5ml血清分装管；外泌小体miRNA提取试剂盒，内含ExoQuick、LysisBuffer、WashBuffer、ElutionBuffer、SeraMirRNAColumns；外参线虫miR39试剂；逆转录试剂盒，内含miRNARTEnzymeMix、2×TSmiRNAReactionMix；hsa-U6引物；cel-miR-39引物；miRNAs引物试剂盒,内含miR-16-5p、let-7d-5p；qPCR检测试剂盒,内含UniversalmiRNAqPCRPrimer(10uM)、TopGreenqPCRSuperMix、PassiveReferenceDye(50×)(Optional)；无RNA酶的EP管；无水乙醇；ddH2O。实施例2使用本专利技术的试剂盒检测早期矽肺患者血清外泌小体miRNAs的方法：一.血清样品采集与处理疑似早期矽肺患者空腹8小时于清晨抽取静脉血5毫升，不抗本文档来自技高网...
【技术保护点】
早期矽肺患者血清外泌小体miRNAs检测试剂盒，其特征在于包括：血清分装管，外泌小体miRNAs提取试剂盒，外参线虫miR39试剂，逆转录试剂盒，hsa‑U6引物，cel‑miR‑39引物，miRNAs引物试剂盒，qPCR检测试剂盒，无RNA酶的EP管，无水乙醇和ddH2O，所述miRNAs引物试剂盒包括SEQ ID NO.1所示的miR‑16‑5p上游引物和SEQ ID NO.2所示的let‑7d‑5p上游引物。
【技术特征摘要】
1.早期矽肺患者血清外泌小体miRNAs检测试剂盒，其特征在于包括：血清分装管，外泌小体miRNAs提取试剂盒，外参线虫miR39试剂，逆转录试剂盒，hsa-U6引物，cel-miR-39引物，miRNAs...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨震，高宏生，彭悦，薛荣，李国良，孟斌，李倩，曾宪焕，张鸽，赵化冰，王毅铮，黄爱华，李欢欢，杨飞飞，
申请(专利权)人：中国人民武装警察部队后勤学院，
类型：发明
国别省市：天津;12
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