提供了用于提高植物对诸如玉米根虫之类的昆虫害虫的抗性的方法和组合物。提供了用于在宿主植物或植物细胞中过表达Crwl或其变体以在植物如玉蜀黍中提高对昆虫害虫的抗性的方法。此外，提供了鉴定Crwl的变体的方法，所述变体在经由转基因手段或传统的育种手段掺入进植物中时可在植物如玉蜀黍中提高对昆虫害虫的抗性。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 相关申请的交叉引用 本申请要求2012年9月20日提交的美国临时申请No. 61/703,396的权益以及 2013年3月14日提交的美国临时申请No. 61/781，057的权益，将这两篇专利申请的全部内 容以引用的方式并入本文。 序列表的引用 序列表作为于2013年9月19日创建的名为"BB2189PCT_Sequences_Listing"的 文本文件于2013年9月20日提交，大小为83, 193字节，特此根据37 C. F. R. § 1. 52 (e) (5) 以引用方式将其并入。
本领域涉及植物育种和遗传学，并且具体而言，涉及可用于玉蜀黍植物中以赋予 对玉米根虫的抗性的重组DNA构建体。
技术介绍
根叶甲属（Diabrotica)甲虫的三个物种的幼虫形式即西部玉米根虫 (Diabrotica virgifera virgifera LeConte)、北部玉米根虫(Diabrotica barberi Smith 和 Diabrotica barberi Lawrence)和南部玉米根虫（Diabrotica undecimpunctata howardi Barber)代表了美国中西部的严重玉米昆虫害虫。大约3000万英亩（120, OOOkm2) 的玉米（总共种植8000万英亩）受玉米根虫的侵扰，美国农业部估计玉米根虫的幼虫可每 年引起大约10亿美元的损失。 有许多不同的管理措施针对玉米根虫的控制，包括玉米品种选择、提早种植、杀虫 剂、轮作以及使用转基因玉米品种；然而，没有一种就其本身而言已被证实可有效管理害 虫。还另外存在复杂的情况，即玉米根虫昆虫已显示出明显的进化出对若干控制措施（包 括杀虫剂、栽培措施以及已引入植物中的抗性基因）的抗性的能力。 因而，仍不断需要可纳入进一体化害虫管理策略中的新的玉蜀黍中的玉米根虫抗 性机制。
技术实现思路
提供了在玉蜀黍植株中提高对昆虫害虫植食性的抗性的方法，其中编码CRWl的 多核苷酸在玉蜀黍植株中表达。 还提供的是鉴定ZmCrwl (或ZmCRWl)的给予玉蜀黍植株提高的对昆虫害虫植食性 的抗性的变体并然后进一步将该变体引入进玉蜀黍植株中的方法。该变体可通过基因改组 实验鉴定或者可以是通过连锁作图（linkage mapping)或全基因组关联分析鉴定的天然存 在的等位基因变体。基因改组引起的变体可通过转基因引入进玉蜀黍植株中以给予它们提 高的抗性，而使用本文给出的方法鉴定的等位基因变体可使用分子育种掺入进玉蜀黍植株 中。 toon] 在一些实施例中，昆虫害虫是鞘翅目昆虫。在其它实施例中，鞘翅目昆虫害虫 属于根叶甲属。在其他实施例中，昆虫害虫是玉米根虫，包括但不限于，西部玉米根虫 (Diabrotica virgifera virgifera LeConte)、北部玉米根虫（Diabrotica barberi Smith 和 Diabrotica barberi Lawrence)和 / 或南部玉米根虫（Diabrotica undecimpunctata howardi Barber)〇 在一些实施例中，昆虫害虫是鳞翅目昆虫。在其它实施例中，鳞翅目昆虫害虫是欧 洲玉米螟。 还提供了分离的多核苷酸、含有所述多核苷酸的重组构建体以及含有所述重组构 建体的植物细胞。 附图和序列表的说明 由以下的"【具体实施方式】"及构成本申请的一部分的附图和序列表可以更完全地 理解本公开。 图1示出了从叶取食选择测定法获得的结果，在该测定法中，将西部玉米根虫 (WCR)甲虫放在具有来自玉蜀黍crwl-Ac突变株的叶子和来自其野生型亲缘株的叶子的盒 子中。结果代表9份生物样品的平均值。 图2示出了玉蜀黍Crwl基因、crwl-Ac突变株系中的突变的位置以及公共的多样 性株系Cd 09和NC316中的插入位置的示意图。 图3绘出了 Crwl突变植株（MT)和野生型（WT)植株响应机械创伤（"机械创伤"） 和秋粘虫毛虫（Fall Armyworm caterpillar)反合（"反合（Regurgitant)"）的茉莉酸 (JA)的定量。与野生型植株（WT)相比Crwl突变植株积累较高水平的JA，但仅响应所施加 的应激。 图4绘出了来自Crwl突变植株（MT)和野生型植株（WT)的幼叶和成叶的对香豆 酸和阿魏酸水平的差异。 图5绘出了 Crwl突变植株（MT)和野生型植株（WT)的叶木质素含量的差异。 图6A-6C示出了来自野生型亲缘株的Crwl的cDNA序列与crwl-Ac突变等位基因 的比对，该突变等位基因是切除原始等位基因中存在的自主Ac转座子而得到的。外显子1 中的8bp插入（加框显示）导致预测的肽链在插入位点处过早终止。 图7A-7C示出了来自野生型亲缘株的Crwl的cDNA序列与crwl-CO 09等位基因 的比对。该crwl-CO 09等位基因与其野生型亲缘株相比，在外显子2中添加了 Ibp的插入 和两个其他的bp变化（参见图7A中的箭头，其指示插入以及bp变化的位置）。在外显子 2中插入Ibp导致CRWl肽的过早终止。 图8A-8C示出了来自野生型亲缘株的Crwl的cDNA序列与crwl-NC316等位基因 的比对。该crwl-NC316等位基因具有Ibp插入（参见图8A中的箭头）并在第二外显子中 具有45bp插入。该Ibp插入的存在导致在45bp插入的位点处出现过早终止密码子。 图 9A-9L 示出了 SEQ ID NO :3、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26和27的多肽的氨基酸序列的多序列比对。当某个位置处的所有残基匹配共有序 列的残基时，则显示该残基；否则显示为另外，精确匹配共有序列的残基加框显示。 图10示出了图9A-9L中所示的多肽的每对氨基酸序列的序列同一性百分数和趋 异值（divergence value) 〇 图 11 示出了 Tl 植株中事件 #8909. 102. I. 17. 4 的 RT-PCR 结果。 SEQ ID NO :1是野生型玉米（Zea mays)基因组Crwl的核苷酸序列。 SEQ ID NO :2是野生型玉米Crwl (ZmCrwl) cDNA的编码区的核苷酸序列。 SEQ ID NO :3是野生型玉米CRWl (CRWlZmCRWl)蛋白的氨基酸序列。 SEQ ID NO :4是突变crwl-Ac等位基因的cDNA的核苷酸序列。 SEQ ID NO :5是突变crwl-Ac等位基因编码的多肽的氨基酸序列。 SEQ ID NO :6是来自玉蜀黍近交系C0109的Crwl cDNA(crwl-C0109)的核苷酸序 列。 SEQ ID NO :7是SEQ ID NO :6编码的多肽的氨基酸序列。 SEQ ID N0:8是来自玉蜀黍近交系NC316的Crwl cDNA(crwl-NC316)的核苷酸序 列。 SEQ ID NO :9是SEQ ID NO :8编码的多肽的氨基酸序列。 SEQ ID NO : 10是来自水稻（Oryza sauva)的次生壁NAC转录因子2的氨基酸序 列（UniProt 条目 G3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种在植物中提高对昆虫害虫植食性的抗性的方法，包括：(a)将重组DNA构建体引入进可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列有效连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有这样的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列基于Clustal W比对方法，当与SEQ ID NO：3、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27比较时，具有至少80％的序列同一性；以及(b)在步骤(a)之后从所述可再生的植物细胞再生出转基因植株，其中所述转基因植株在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且当与不包含所述重组DNA构建体的对照植株比较时展现出提高的对植物害虫的抗性。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：DS穆尔塔尼，GS乔哈尔，BKP文卡塔，
申请(专利权)人：先锋国际良种公司，普渡研究基金会，
类型：发明
国别省市：美国;US
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