本发明专利技术提供遗传性视神经病变基因检测方法、SNP基因芯片和试剂盒。该试剂盒包括检测视神经病变基因SNP的多重PCR探针、引物。该芯片具有针对13个线粒体基因46个SNP位点的检测探针。利用试剂盒及基因芯片进行检测，通过标记样本扩增、杂交、对杂交信号进行扫描、芯片数据获得与处理、判断SNP位点，根据数字信号判读视觉病变基因的SNP位点信息。本发明专利技术克服了直接测序使用样本量大而采血样多、扩增时间长、次数繁多、易出现假阳性或假阴性等缺陷，减轻被检者的痛苦，即提高检测准确性，又节省检测时间。本发明专利技术具有快速、高通量特点的芯片试剂盒，能更好的有利于疾病的早期诊断与治疗，便于在全国范围内大规模筛查和预防性检查。
【技术实现步骤摘要】
遗传性视神经病变基因检测方法、基因芯片和试剂盒
本专利技术属于生命科学与生物
，具体涉及遗传性视神经病变基因SNP检测固相芯片、探针以及相关的检测试剂盒。本专利技术主要提供了：(1)提供遗传性视神经疾病基因SNP检测芯片，该芯片包括针对13个线粒体基因的46个SNP位点的的117条探针系列；(2)提供检测SNP位点的探针的制备引物；(3)提供一种用于眼科疾病相关基因SNP检测的试剂盒；(4)提供了更全面检测遗传性视神经病变基因的SNP位点的方法。
技术介绍
Leber遗传性视神经病变(Leber'sHereditaryOpticNeuropathy，LHON，简称Leber氏病)是一种母系遗传性视神经病变，主要累及视网膜、巩膜筛板前部视乳头黄斑束纤维，导致视神经退行性变的母系遗传病，严重的影响着人们正常的生产、生活。根据国家卫生部(http://www.moh.gov.cn/)最新数据统计我国现有的低视力人口约有710万，盲人约有500万，占总人数的0.4％，成为世界上视力损伤最严重的国家之一。其中，由视神经病变引起的约为55万。目前已报道40多种线粒体DNA突变位点与LHON致病相关(http://www.mitomap.org/)，其中90％以上的LHON的家系是由氧化磷酸化复合物I亚基上的ND4G11778A、ND1G3460A和ND6T14484C这3个原发突变位点所致。除上述3个原发性突变位点外，还有近50个线粒体DNA突变与LHON相关，与线粒体相关的原发性Leber氏病在早期临床症状不明显，早期的检查常常会因此被耽误，尤其在我国偏远农村地区，这种情况普遍存在。因此，在高危人群和易感人群中开展mtDNA突变筛查，对于预防和控制与线粒体相关的原发性Leber氏病的发生有着极其重要的作用。自发现与mtDNA突变相关的疾病以来，检测线粒体突变位点的检测方法主要还是序列测定。直接测序法是鉴定突变的黄金标准，但该操作繁琐，费用昂贵限制了它的广泛应用。近年来，国内相继报道了Leber遗传性视神经病变的基因诊断试剂盒及其检测方法，以满足对线粒体突变突变进行广泛筛查的需要，如福建医科大学于2005年申请了的基因诊断试剂盒及其检测方法专利(专利号：200510006097.8)，该专利技术是根据90％以上的Leber氏遗传性视神经病变患者的线粒体DNA突变属于3个原发性致病位点突变(G11778A、G3460A和T14484C)，设计和合成位点特异性PCR引物，直接以全血样作PCR的DNA模板，利用等位基因特异性多重PCR技术，单管一次性PCR反应，同时检测LHON患者的线粒体DNA的3个原发性致病突变位点，具有简便快速、高效、费用低、特异性好、只需微量血液样本等优点，为LHON患者的快速临床基因诊断提供一种简易、可靠的方法和试剂盒，具有巨大的普及推广应用价值。但是该方法存在血液中直接PCR扩增的难度加大，实验中采取的多重PCR的条件要求将会增加，检测方法跟普通的方法没有本质的区别。2006年杭州优思达生物科技有限公司建立一种以单核苷酸多态性核酸试纸快速检测LHON线粒体DNA中G11778A位点突变的新方法(专利号：200610003429.1)。在应用单核苷酸多态性核酸检测试纸条进行多态位点或突变位点的检测时,需要设计一条特异性延伸引物，这条引物的3’端碱基紧临多态性碱基或突变碱基,其在DNA聚合酶的作用下开始延伸,带有抗原标记与模板对应的双脱氧单核苷酸(ddNTP)被连接到延伸引物上。虽然该方法能够实现短时间内的检测阳性位点，但PCR扩增条件严格，存在假阴性的几率大大增加。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前检测线粒体DNA突变位点的方法所存在的缺点，提供一种具有快速、高通量特点的试剂盒，能更好的有利于该疾病的早期诊断与治疗的遗传性视神经病变基因SNP检测。本专利技术提供的试剂盒，由视神经病变基因SNP检测的固相基因芯片、多重PCR所需要的探针组分、多重PCR反应液、该试剂盒杂交液与洗脱液成分构成。其中，视神经病变基因SNP检测的固相基因芯片包括固相载体以及固定于固相载体上的检测探针(21个碱基，表1)，检测探针具有如SEQIDNo：1-117所示的序列，固相载体可以硅片或玻片等材质(但不限定于上述材质)，表面用氨基或者醛基修饰；多重PCR所需要的探针包括多重PCR引物，具有如SEQIDNo：118-133所示的序列：样本前向引物1：ACAGGGTTTGTTAAGATGGCAGA(ID:SEQ118),反向引物1：GACTAGTTCGGACTCCCCTTCG(ID:SEQ119)；前向引物2：CCCCTTCGCCCTATTCTTCAT(ID:SEQ120)，反向引物2：GGTGCCTTGGGTAACCTCTGG(ID:SEQ121)；前向引物3：CTACTCAACTTAAACTCCAGCACCA(ID:SEQ122)，反向引物3：AGGGGAGATAGGTAGGAGTAGCGT(ID:SEQ123)；前向引物4：ACCTACTCATGCACCTAATTGGAAG(ID:SEQ124)，反向引物4：TATTAGTTGGCGGATGAAGCAGA(ID:SEQ125)；前向引物5：GATACTGGCATTTTGTAGATGTGGT(ID:SEQ126)，反向引物5：TTTTTGGAAAGTCATGTCAGTGG(ID:SEQ127)；前向引物6：TTATCCAGTGAACCACTATCACGAA(ID:SEQ128)，反向引物6：ACGTGGTTACTAGCACAGAGAGTTC(ID:SEQ129)；前向引物7：CTTACGACCCCTTATTTACCGAGA(ID:SEQ130)，反向引物7：GTGAGGCTTGGATTAGCGTTTAGA(ID:SEQ131)；前向引物8：TCCTAGCAGCAGCAGGCAAAT(ID:SEQ132)，反向引物8：CTCGGGGGAATAGGTTATGTGA(ID:SEQ133)。多重PCR反应液，包括Phusion等高保证酶2U/uL、Phusion反应buffer、dATP100mM，dTTP100mM,dGTP100mM,dCTP100mM、Cy3-dCTP10mM、PrimerMix、10μM、PCR纯化磁珠和无水乙醇；该试剂盒杂交液与洗脱液成分包括杂交液：6XSSPE，25％甲酰胺，PH6.6to6.8、洗脱液：3XSSPE,12.5％甲酰胺，10％SDS，PH6.6to6.8、封闭液：6XSSPE，25％甲酰胺，BSA(0.1mg/ml)，PH6.6to6.8。所采用的该试剂盒的阳性对照为人的GADPH基因和β-globin基因，其扩增引物序列以及对应探针如下所示，其中此两对引物与待检测的遗传性视神经病变基因：GADPH前向引物GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，GADPH反向引物CCTGGAAGATGGTGATGGGAT，GADPH探针序列GCCATCAATGACCCCTTCATT、GCCATCAATCACCCCTTCATT；β-globin前向引物GTGGATGAAGTTGGTGGTGAGG，β-globin反向引物CCAGTTTAGTA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种遗传性视神经病变基因检测试剂盒，其特征在于，包括检测视神经病变基因SNP的多重PCR探针、引物对，所述探针具有如SEQ ID No：1‑117所示的序列，所述引物对具有如SEQ ID No：118‑133所示的序列。
【技术特征摘要】
1.一种遗传性视神经病变基因检测试剂盒，其特征在于，包括检测视神经病变基因SNP的多重PCR探针、引物对，所述探针为SEQIDNo：1-117所示的序列，所述引物对为SEQIDNo：118-133所示的序列。2.一种用于检测遗传性视神经病变基因芯片，其特征在于，该芯片具有针对13个线粒体基因46个SNP位点的如SEQIDNo：1-117所示的序列。3.根据权利要求2所述的基因芯片，其特征在于，还包括阳性对照，所述阳性对照为人的GADPH基因和ß-globin基因，其扩增引物序列以及对应探针如...
【专利技术属性】
技术研发人员：管敏鑫，蒋萍萍，冀延春，郎秋雷，张娟娟，梁敏，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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