一种鹿茸骨膜组织的转基因方法技术

本发明专利技术公开了一种鹿茸骨膜组织的转基因方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术所提供的方法是利用脂质体包裹携带标记基因的病毒质粒，再将包裹后的病毒质粒转染到包装细胞中生成病毒颗粒，收集含病毒颗粒的细胞培养液上清液，浓缩后保存备用，采集鹿茸的骨膜组织，切割后利用包装好的病毒颗粒进行感染，最后将经过病毒感染的鹿茸骨膜组织移植到动物体内，鹿茸萌发后获得转基因鹿茸组织。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于基因工程

技术介绍
动物组织转基因技术已经发展多年，常见的技术有通过向生殖细胞，胚胎注射外源基因及病毒载体等构建全身转基因的动物，或者通过构建含组织特异性启动子的病毒载体，获得组织特异性转基因动物。但是上述方法有如下弊端，首先是转基因的不确定性，通过生殖细胞/胚胎导入外源基因获得全身转基因动物，外源基因是随机整合的这就导致转基因的不确定性，随之整合的基因可能会影响动物内源基因的正常功能而影响动物的健康；另一方面随机整合也不便于在特定组织中分析某一或某些基因的功能或者获得组织特异性的目的基因的表达，例如哺乳动物器官生物反应器的获得。其次，组织特异性转基因动物建立的条件太苛刻，该方法获得转基因的先决条件是存在某种组织特异性启动子，并对其加以改造从而获得组织特异性转基因的效果。但是绝大数的基因的表达在空间序列上不具备组织特异性，甚至可能是全身表达的。另外在时间序列上这种限制也非常明显，某些基因只在动物某个组织的发育的特定阶段表达，在此时间节点之前、之后绝不表达。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了，所采取的技术方案如下:本专利技术的目的在于提供，该方法是利用脂质体包裹携带外源基因的病毒质粒，再将包裹后的病毒质粒转染到包装细胞中生成病毒颗粒，收集含病毒颗粒的细胞培养液上清液，浓缩后保存备用，采集鹿茸的骨膜组织，切割后利用包装好的病毒颗粒进行感染，最后将经过病毒感染的鹿茸骨膜组织移植到动物体内，鹿茸萌发后获得转基因鹿茸组织。所述方法的步骤如下:I)利用脂质体包裹携带有外源基因的病毒质粒，再将包裹好的病毒质粒与包装细胞293t —同孵育，孵育结束后获得含病毒颗粒的转染细胞液；2)收取步骤I)所得的转染细胞液，离心除去破碎细胞后，收集上清液超滤浓缩获得病毒液，保存备用；3)采集鹿茸骨膜组织，切割鹿茸骨膜组织后置于含有培养基的培养板中备用；4)将步骤2)所得的病毒液制成病毒感染液并感染到步骤3)所得的鹿茸骨膜组织，感染后培养，获得感染组织；5)将步骤4)所得的感染组织移植到动物体内，鹿茸萌发后获得转基因鹿茸组织。优选地，步骤I)所述病毒质粒，是慢病毒质粒，分别是质粒P113.7、衣壳质粒pMDG、包装质粒 pMDLg/pRRE、pRSV_rev ;所述脂质体，是脂质体 Lipofectamine 2000。更优选地，所述质粒P113.7、衣壳质粒pMDG、包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV_rev，按照1:1:1:1的质量比进行包裹，添加量为3 μ g。优选地，步骤I)所述孵育，是在37°C，5% CO2的条件下孵育5h，孵育使用的培养基是含有10% FBS的DMEM，孵育结束后更换含有10% FBS、I %谷氨酰胺、双抗100U/ml的DMEM完全培养基。优选地，步骤2)所述超滤浓缩，使用0.45 μπι滤器过滤上清液，在利用离心超滤管，在4°C、5000g的条件下离心30min。优选地，步骤3)所述鹿茸骨膜组织，是鹿生茸区鹿茸骨膜组织；所述切割鹿茸骨膜组织，鹿茸骨膜组织的切割厚度为0.18-0.22mm ;所述含有培养基的培养板，是每孔含有200-400 μ LDMEM的6孔培养板；培养基含有10% FBS和100U/mL双抗。优选地，步骤4)所述将病毒液制成病毒感染液，是吸干病毒液中培养基后，将病毒与助染剂Polybrene及DMEM培养基混合，使得最终每ImLDMEM培养基中含有10% FBS,100U双抗，1yg助染剂Polybrene，病毒的滴度为3.32X 107TU/mL ;所述感染是在每个培养孔中加入2mL病毒感染液，每隔3天更换病毒感染液I次，连续感染3周。所述方法的具体步骤如下:I)利用脂质体Lipofectamine 2000包裹携带有外源基因的病毒质粒P113.7、衣壳质粒pMDG、包装质粒pMDLg/pRRE，pRSV_rev,再将上述包裹好的病毒质粒与包装细胞293t在37°C，5% CO2的条件下孵育5h孵育使用的培养基是含有10% FBS的DMEM，孵育结束后更换含有10% FBS、1%谷氨酰胺、双抗100U/ml的DMEM完全培养基，孵育结束后获得转染细胞液；2)转染24h后收取步骤I)所得的转染细胞液，离心去除破碎细胞，再使用0.45 ym滤器过滤上清液，在利用离心超滤管，在4°C、5000g的条件下离心30min获得病毒液，保存备用；3)采集鹿生茸区骨膜组织，并将骨膜组织切割成0.2_厚的薄片，置于每孔含有200-400 μ L DMEM的6孔培养板中，培养基含有10% FBS和100U/mL双抗；4)吸干步骤2)所得的病毒液中培养基后，将病毒与助染剂Polybrene及DMEM培养基混合，使得最终每ImLDMEM培养基中含有10% FBS，100U双抗，10 μ g助染剂Polybrene，病毒的滴度为3.32 X 107TU/mL，再在每个培养孔中加入2mL病毒感染液，每隔3天更换病毒感染液I次，连续感染3周，获得感染组织；5)将步骤4)所得的感染组织移植到动物体内，鹿茸萌发后获得转基因鹿茸组织。所述任一方法用于获得组织转基因动物。本专利技术获得的有益效果如下:本专利技术所提供的方法将标记基因导入鹿茸骨膜组织，成功的构建出转基因鹿茸组织，对鹿茸特异性蛋白的表达以及药物开发具有重要意义。【附图说明】图1为感染后待移植的鹿茸组织；(A，荧光镜下的组织块；B，光镜下的组织块)。图2为转基因鹿茸的生成；(A，移植三周后鹿茸萌发；B，携带报告基因的鹿茸组织)。图3为转基因鹿茸荧光检测；(A，鹿茸切片荧光观察；B，鹿茸切片可见光观察)。【具体实施方式】下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受实施例的限制。以下实施例所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。实施例1重组慢病毒的包装1.取出一定数目的1cm细胞培养皿，每板中加入4ml 0.01 %的多聚赖氨酸，左右颠倒，使液体平铺于板底，室温下孵育1min后，吸取上清液。2.0.25%胰酶消化293t细胞并计数，接种细胞于上述1cm细胞培养皿中，每板加1mlDMEM中，含10% FBS不含抗生素，使细胞在转染日的融合度达到90%。3.对于每板细胞，使用1.5ml无血清DMEM稀释24 μ g DNA (质粒Pl 13.7:衣壳质粒pMDG:包装质粒pMDLg/pRRE:pRSV_rev质量比为1:1:1:1，每个质粒的添加量为3 μ g)，使用1.5ml无血清DMEM稀释51 μ I Lipofectamine 2000，室温下孵育5min。4.将稀释的DNA和稀释的Lipofectamine 2000混合于一体，混合液在室温孵育30mino5.吸去1cm细胞培养皿中的培养液将复合物加入到细胞培养皿中，摇动培养板，轻轻混匀。6.将细胞培养皿在37°C，5% CO2，孵箱孵育5h，5h后更换DMEM完全培养基(10%FBS、1%谷氨酰胺、双抗100U/ml)。7.24h后，倒置荧光显微镜下检测GFP表达情况以确定转染效率。实施例2病毒的浓缩及保存1.第一次收毒:转染后24h时，小心吸取1cm细胞培养皿中培养液于一干净无菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鹿茸骨膜组织的转基因方法，其特征在于，利用脂质体包裹携带外源基因的病毒质粒，再将包裹后的病毒质粒转染到包装细胞中生成病毒颗粒，收集含病毒颗粒的细胞培养液上清液，浓缩后保存备用，采集鹿茸的骨膜组织，切割后利用包装好的病毒颗粒进行感染，最后将经过病毒感染的鹿茸骨膜组织移植到动物体内，鹿茸萌发后获得转基因鹿茸组织。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨福合，李春义，褚文辉，孙红梅，刘振，王大涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：吉林;22