活性蛋白基因在芦荟中融合表达应用的方法技术

本发明专利技术公开了一种活性蛋白基因在芦荟中融合表达应用的方法，先构建植物转基因载体，用植物转基因载体的质粒分别转化LBA4404和EHA105农杆菌，划线培养，取单菌落做菌落PCR鉴定得到转化子进行培养并收集菌体悬浮于等体积MS培养基中，浸染芦荟愈伤组织，除去芦荟愈伤组织上的农杆菌，把浸染后的芦荟愈伤组织放到MS分化培养基上培养；用MS培养基中漂洗芦荟愈伤组织至彻底洗去农杆菌，除去水分；芦荟愈伤组织置于含Kan和头孢霉素抗生素的MS分化培养基上培养至组织下部生出白色根；把芦荟组织放到阴凉地方种植于营养土上，采用22度1000-2000lux光照培养即得芦荟植株。用本发明专利技术生产的芦荟凝胶汁液，富含活性肽，易保存，生产成本低，适于大批量生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物转基因应用
，具体涉及。
技术介绍
活性蛋白是一种复杂的有机化合物，组成蛋白质的基本单位是氨基酸，氨基酸通过脱水缩合形成肽链。蛋白质是由一条或多条多肽链组成的生物大分子，每一条多肽链有二十至数百个氨基酸残基不等；各种氨基酸残基按一定的顺序排列。蛋白质的氨基酸序列是由对应基因所编码。除了遗传密码所编码的20种“标准”氨基酸，在蛋白质中，某些氨基酸残基还可以被翻译后修饰而发生化学结构的变化，从而对蛋白质进行激活或调控。多个蛋白质可以一起，往往是通过结合在一起形成稳定的蛋白质复合物，发挥某一特定功能，产生蛋白质的细胞器是核糖体。活性蛋白对环境的要求很高，高浓度的生物蛋白在常温下保存很容易失去活性，为了确保这些珍稀成分的特殊活性与功能，只能采取生物冻干工艺，在无菌环境下采用-80度的极速超低温真空冻干技术，使生物活性蛋白进入休眠状态，达到完整的保存其生物活性的目的。随着人年纪的增大，本身皮肤表达的蛋白(尤其是胶原蛋白)会下降，导致皮肤会越来越不好，市场上化妆品添加的活性肽物质如EGF即重组人表皮生长因子，都是采用工程菌表达纯化，水溶后不易保存，而且生产成本高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案:，包括以下步骤:(一)、构建 pCOMBIA 1301+MT/EGF、pCOMBIA 1301+MT/AFGF、pCOMBIA 1301+MT/BFGF, pCOMBIA 1301+MT/KGF、pCOMBIA 1301+MT/PIGF、pCOMBIA 1301+EGF/AFGF、pCOMBIA1301+EGF/BFGF、pCOMBIA 1301+EGF/KGF、pCOMBIA 1301+EGF/PIGF、pC0MBIA1301+PDGF、pCOMBIA 1301+MT/PIGF-2,pCOMBIA 1301+EGF/PIGF-2,pCOMBIA 1301+adiponectin 植物转基因载体；(二)、用步骤(一)中的13个植物转基因载体的质粒分别转化LBA4404和EHA105农杆菌，划线培养，挑取单菌落做菌落PCR鉴定，得到正确的转化子进行培养；(三)、培养至0D600= 0.1-0.2，收集菌体悬浮于等体积MS培养基中，浸染芦荟愈伤组织15-30分钟；(四)、除去芦荟愈伤组织上的农杆菌，把浸染后的芦荟愈伤组织放到MS分化培养基上培养；三天后用含抗生素Kan和头孢霉素的液体MS培养基中漂洗芦荟愈伤组织至彻底洗去农杆菌，除去水分；(五)、除去水分后的芦荟愈伤组织置于含Kan和头孢霉素抗生素的MS分化培养基上培养，I个月后愈伤组织生出芽来，继代培养，2个月后生出小叶，叶长大至2-3cm后，继代生根培养基继续培养，1-2个月愈伤组织下部生出2-3根白色根；(六)、把芦荟组织放到阴凉地方种植于营养土上，采用22度1000-20001UX光照培养得到能特异表达目的蛋白的芦荟植株。在上述技术方案的所述步骤(四)中，用无菌滤纸吸干芦荟愈伤组织上的农杆菌，采用无菌滤纸吸干水分，避免转基因植物坏死。所述步骤(五)中，用无菌滤纸吸干芦荟愈伤组织上的水分，采用无菌滤纸吸干水分，避免转基因植物坏死。在上述技术方案的步骤(二 )中转化子检测方法:用特异引物以单菌落为模板进行PCR扩增，如扩增出和目的片段一样的条带，该为转化子正确的转化子。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是:本专利技术采用农杆菌浸染芦荟组织，把活性蛋白应用于芦荟中，以芦荟为平台大量生产人需要的活性肽，一方面从源头直接参与皮肤细胞的基因表达与生理信号的传递，修复细胞，阻断老化，另一方面营养肌肤，提高肌肤自身的调节能力，立体构建和维护皮肤的生态环境，实现逆龄护肤，达到美容目的，本专利技术采1-3年的芦荟叶子为原料，转基因芦荟不会开花结果，不会对生态环境造成污染，生产的富含活性肽的芦荟易保存，而且生产成本低，适于大批量生产。目前国内成功运用转基因芦荟进行活性蛋白生产的成功案例几乎没有，本申请的专利技术人经过无数次芦荟转基因实验，成功实现了芦荟转基因，使得大量生产活性肽如表皮生长因子成为能够实施的现实，基本满足需求量每年达几十吨的市场需求。本专利技术以本身为一种美容植物的芦荟为载体，表达特异的有美容功效的活性肽，活性肽由芦荟自身表达，芦荟对自身表达的活性肽形成保护机制，减少因工程表达活性肽而带来的环境污染，同时活性肽由芦荟自身表达易保存。本专利技术生产的富含活性肽的芦荟，制成的芦荟凝胶汁液，富含活性肽，易保存，生产成本低，适于大批量生产。【具体实施方式】下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术提供的，构建PC0MBIA1301+MT/EGF、pC0MBIA1301+MT/AFGF、pC0MBIA1301+MT/BFGF、pC0MBIA1301+MT/KGF、pC0MBIA1301+MT/PIGF、pC0MBIA1301+EGF/AFGF、pC0MBIA1301+EGF/BFGF、PC0MBIA1301+EGF/KGF、p⑶MBIA1301+EGF/PIGF、pC0MBIA1301+PDGF、pC0MBIA1301+MT/PIGF-2、pC0MBIA1301+EGF/PIGF-2、pC0MBIA1301+adiponectin 植物转基因载体，分别用构建的13个植物转基因载体质粒转化LBA4404和EHA105农杆菌，划线培养，挑取单菌落做菌落PCR鉴定，得到正确的转化子进行培养，用特异引物以单菌落为模板进行PCR扩增，如扩增出和目的片段一样的条带，该为转化子正确的转化子；培养至0D600 = 0.1-0.2，收集菌体悬浮于等体积MS培养基中，浸染芦荟愈伤组织15-30分钟，用无菌滤纸吸干组织上的农杆菌。把浸染后的芦荟愈伤组织放到MS分化培养基上培养。三天后用液体MS培养基含抗生素(Kan和头孢霉素)漂洗组织8-10次，彻底洗去农杆菌，用无菌的滤纸吸干水分，置于含抗生素(Kan和头孢霉素)MS分化培养基上培养。I个月后愈伤组织能生出芽来，继代培养，2个月后可以生出小叶，等叶长大至2-3cm后，继代生根培养基继续培养，1-2个月愈伤组织下部会生出2-3根白色小根，洗去培养基，把芦荟组织放到阴凉地方，种植于营养土上，采用22度1000-20001uX光照培养得到能特异表达目的蛋白的芦荟植株。本实施例中:MT/EGF融合基因序列:ATGGACCCCAACTGCTCCTGCGAGGCTGGTGGCTCCTGCGCCTGCGCCGGCTCCTGCAAGTGCAAAAAGTGCAAATGCACCTCCTGCAAGAAGAGCTGCTGCTCCTGTTGCCCCCTGGGCTGTGCCAAGTGTGCCCAGGGCTGCATCTGCAAAGGGGCGTCAGAGAAGTGCAGCTGCTGTGCCAACTCTGACTCTGAATGTCCGCTGAGCCATGACGGTTATTGCCTGCATGATG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种活性蛋白基因在芦荟中融合表达应用的方法，其特征在于，包括以下步骤:(一)、构建pCOMBIA 1301+MT/EGF、pCOMBIA 1301+MT/AFGF、pCOMBIA 1301+MT/BFGF、pCOMBIA 1301+MT/KGF、pCOMBIA 1301+MT/PIGF、pCOMBIA 1301+EGF/AFGF、pCOMBIA 1301+EGF/BFGF、pCOMBIA 1301+EGF/KGF、pCOMBIA 1301+EGF/PIGF、pCOMBIA1301+PDGF、pCOMBIA 1301+MT/PIGF‑2、pCOMBIA 1301+EGF/PIGF‑2、pCOMBIA 1301+adiponect in植物转基因载体；(二)、用步骤(一)中的13个植物转基因载体的质粒分别转化LBA4404和EHA105农杆菌，划线培养，挑取单菌落做菌落PCR鉴定，得到正确的转化子进行培养；(三)、培养至0D600＝0.1‑0.2，收集菌体悬浮于等体积MS培养基中，浸染芦荟愈伤组织15‑30分钟；(四)、除去芦荟愈伤组织上的农杆菌，把浸染后的芦荟愈伤组织放到MS分化培养基上培养；三天后用含抗生素Kan和头孢霉素的液体MS培养基中漂洗芦荟愈伤组织至彻底洗去农杆菌，除去水分；(五)、除去水分后的芦荟愈伤组织置于含Kan和头孢霉素抗生素的MS分化培养基上培养，1个月后愈伤组织生出芽来，继代培养，2个月后生出小叶，叶长大至2‑3cm后，继代生根培养基继续培养，1‑2个月愈伤组织下部生出2‑3根白色根；(六)、把芦荟组织放到阴凉地方种植于营养土上，采用22度1000‑2000lux光照培养得到能特异表达目的蛋白的芦荟植株。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：程孟荣，徐庆安，周卫，
申请(专利权)人：夏松，
类型：发明
国别省市：湖北;42