本发明专利技术涉及一种病毒基因组核酸提取试剂盒及其使用方法。该发明专利技术的特征在于试剂盒包括蛋白酶K、硅基修饰磁珠、提取缓冲液、漂洗液I、漂洗液II及无RNA酶水等，并配套含有磁力架。本发明专利技术病毒基因组核酸提取试剂盒使用方法的特征在于采用在提取缓冲液中加入蛋白酶K和硅基修饰磁珠一次性消化液裂解细胞并吸附裂解释放出来的病毒核酸，同时提取缓冲液中含有硫氰酸胍在pH值为5.5时使得硅基修饰磁珠更大量吸附核酸，每1克硅基修饰磁珠吸附核酸达到10mg以上；同时还含有十六烷基三甲基溴化铵去除蛋白、多糖、酚类等杂质，聚乙烯吡咯烷酮K25去除溶液中色素；磁力架上吸附硅基修饰磁珠进一步纯化获得高浓度基因组核酸。本发明专利技术试剂盒提取病毒基因组核酸时，不用事先对来源标本进行单独消化裂解、洗涤和再萃取的过程，为临床检测节约时间，也大大减少了成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种从临床标本中提取病毒基因组核酸试剂盒及其利用本专利技术试剂 盒从临床标本中提取病毒基因组核酸的方法。本专利技术试剂盒可用于血浆、血清、淋巴液、 脱落细胞、唾液、尿液、粪便和培养细胞上清液等，高效率提取获得病毒基因组核酸，可用于 PCR扩增、筛查突变、基因分型、基因测序和样本储存等科研或临床诊断分析。
技术介绍
完整的病毒颗粒包括外壳蛋白和内部的基因组DNA或RNA，每种病毒颗粒中只含 有一种核酸，或为DNA或为RNA。病毒必须借助宿主细胞，利用宿主的复制系统，按照病毒基 因的指令复制新的病毒而繁殖。 研宄发现大多数逆转录病毒有一特殊的致癌基因，可使细胞发生恶性转化。如大 约70%的宫颈癌病例与HPV-16和HPV-18这两种病毒有关；Epstein-Barr (EB)病毒与鼻咽 癌、幽门螺杆菌与胃癌、乙型和丙肝肝炎病毒与肝癌、人类嗜T淋巴细胞病毒1型与白血病 以及艾滋病病毒与卡波西肉瘤等均有着十分密切的关系。病毒基因组核酸编码了所有的病 毒生命信息，从基因水平分析可以早发现、早诊断病毒的发生，为临床早治疗提供保证，防 止癌症的发生。因而，获取病毒基因组核酸是科研和临床检测的关键，高效率提取病毒基因 组核酸就尤为重要了。 目前临床常用的病毒基因组核酸提取方法有酚抽提法、异丙醇沉淀法以及甲酞胺 裂解法，能够满足各种试验的要求，但操作繁琐，用时长，且所用试剂具有一定的毒性；玻璃 颗粒吸附法对DNA提取效果较好，但对RNA吸附能力一般，无法满足提RNA病毒的要求。 目前市场常用的病毒基因组核酸提取试剂盒产品分别是针对DNA和RNA提取的， 很少将DNA和RNA同时提取进行下一步科研或临床检测需要。病毒基因组核酸采用磁珠或 硅基磁珠法利用特异性吸附DNA和RNA能力，通过漂洗取出蛋白质和其他杂质，后用低盐溶 液洗脱得到基因组DNA，操作中未用到酚、氯仿等有机溶剂以及强碱，但用磁珠或硅基磁珠 对DNA和RNA吸附能力不足，获取的DNA和RNA浓度不高。 本专利技术利用能快速提取病毒基因组核酸的硅基磁珠法，不使用有机溶剂或强碱的 同时，还能快速获取高浓度的DNA和RNA，以备下一步科研或临床检测足够使用。
技术实现思路
本专利技术提供一种从临床标本高效地提取病毒基因组核酸的试剂盒及其从提取病 毒基因组核酸的方法，血浆、血清、淋巴液、脱落细胞、唾液、尿液、粪便和培养细胞上清液 等，提取得到高浓度的病毒基因组核酸可用于科研或临床检测之用。 本专利技术是专利技术人多年来对上万例临床标本的提取病毒基因组核酸工作经验和技 术改进，发现在含有硫氰酸胍在PH值为5. 5时使得硅基修饰磁珠发挥更大吸附核酸能力， 每1克硅基修饰磁珠吸附核酸达到IOmg以上，包括DNA和RNA ;另外还发现十六烷基三 甲基溴化按（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB)是一种阳离子去污剂，具在 高离子强度的溶液中（>〇. 7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不 能沉淀核酸，可以去除标本中绝大数的蛋白、多糖、酚类等杂质；以及加入聚乙烯吡咯烷酮 (polyvinyl pyrrolidone，PVP)K25能与多酷形成一种不溶的络合物质，有效去除多酷，减 少核酸中酚的污染，去除溶液中色素，同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。 本专利技术在一个提取缓冲液1中一次性完成对标本的细胞裂解和DNA释放；蛋白、糖 类和酚类等杂质的去除；硅基修饰磁珠吸附核酸等一系列过程。同时本专利技术采用磁力架配 合硅基修饰磁珠使用，在临床检测中可以建立一个核酸提取平台，只需在磁力架上吸附磁 珠并用乙醇洗涤以及无 RNA酶水洗脱，即可获得高浓度病毒基因组核酸。因而，建立起的这 一平台，将方便快捷的获取临床标本中核酸，以便进一步PCR扩增或基因检测。 本专利技术所提供的一种用于提取病毒基因组核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂 盒由蛋白酶K、硅基修饰磁珠、提取缓冲液、漂洗液I、漂洗液II及无 RNA酶水组成，并配套 含有磁力架；其中，优选，所述提取缓冲液由硫氰酸胍、十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯吡咯 烷酮K25、Tris-HCl、EDTA以及NaCl组成；优选，所述提取病毒基因组核酸，经超微量分光 光度计检测，其A260/A280比值大于I. 8 ;A260/A230的比值大于2. 0 ;超微量分光光度计检 测50 μ 1脱落细胞液提取的核酸效率达到50 μ g/ml以上。 toon] 本专利技术所提供的一种病毒基因组核酸提取试剂盒，优选各组成分别为： 1)蛋白酶 K :为 10-100mg/ml 蛋白酶 K，Iml/ 支； 2)娃基修饰微球G :l-100mg/ml，1 μπι娃基修饰微球，Iml/支； 3)提取缓冲液1(1-20Μ硫氰酸胍，1-5 % %十六烷基三甲基溴化铵（质量体 积比），〇· 5-5 %聚乙烯吡咯烷酮Κ25 (质量体积比），IOOmM Tris-HCl (pH5. 5)，25mM EDTA (ρΗ5· 5)，2. OM NaCl)，20ml/ 瓶； 4)漂洗液 I :70% 乙醇，30ml/ 瓶； 5)漂洗液 II :96% 乙醇，60ml/ 瓶； 6) RNase-Free 去离子 H2O :电阻率大于 18M Ω *cm，IOml/ 瓶。 上述病毒基因组核酸提取试剂盒并配置1个磁力架，可用于样本的50次病毒基因 组核酸提取，并可组成100次、200次和500次等病毒基因组核酸提取试剂盒，含使用说明书 一份，试剂盒保存在4°C冰箱，有限期为1年。 所述病毒基因组核酸提取试剂盒中提取缓冲液1，优选地为含有1-20M硫氰酸胍， 更优选地含有4M硫氰酸胍。 所述病毒基因组核酸提取试剂盒中提取缓冲液1，优选地为含有2%十六烷基三 甲基溴化铵和2%聚乙烯吡咯烷酮K25。 本专利技术所提供的病毒提取基因组核酸的方法，其特征在于包括以下步骤： 1)取1个I. 5ml无核酸酶的离心管，加入20 μ 1蛋白酶K和15 μ 1磁珠悬浮液G， 再加入300 μ 1提取缓冲液1。 2)加入200 μ 1血浆/血清/淋巴液/脱落细胞上清，用移液器吹吸或涡旋振荡混 匀；56°C孵育lOmin，期间每3min用移液器吹吸或上下颠倒混匀lOsec，使磁珠和核酸充分 结合。 3)将离心管置于磁力架上lmin，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体；将离 心管从磁力架上取下，加入500 μ 1漂洗液I，涡旋混匀lmin。 4)将离心管放置于磁力架上静置30sec，待磁珠完全吸附时小心去除液体；将离 心管从磁力架上取下，加入500 μ 1漂洗液II，涡旋混匀lmin。将离心管放置于磁力架上静 置30sec，待磁珠完全吸附时小心去除液体； 5)重复步骤3、4,液体尽量去除干净；离心管于磁力架上，室温晾干5-10min。将 离心管从磁力架上取下，加入50μ1 RNase-free ddH20,祸旋混勾； 6)将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时小心将核酸溶液转移 至新的离心管中，并于_20°C保存备用。 本专利技术提供的用于病毒基因组核酸提取试剂盒及其方法不限于人类标本，还可以 用于哺乳动物、禽类、两栖类动物等；需要的标本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于提取病毒基因组核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由蛋白酶K、硅基修饰磁珠、提取缓冲液、漂洗液I、漂洗液II及无RNA酶水组成；所述试剂盒配套含有磁力架；其中，所述提取缓冲液由硫氰酸胍、十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮K25、Tris‑HCl、EDTA以及NaCl组成；所述提取的病毒基因组核酸，经超微量分光光度计检测，其A260/A280比值大于1.8；A260/A230的比值大于2.0；超微量分光光度计检测50μl脱落细胞液提取的核酸效率达到50μg/ml以上。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曾沃坦，黄启明，梁辰，严兰兰，徐晓洁，廖文敏，
申请(专利权)人：益百尚北京生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。