一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记及制备方法和应用，分子标记的制备步骤包括：1)利用在油菜遗传图谱上均匀分布的91个单位点SSR标记对576份来自世界各地的油菜品种进行基因型和群体结构分析并结合千粒重性状数据进行关联分析。2)利用白菜和油菜全基因组序列信息在标记BrSF7-181附近开发了14个高质量的SSR标记再次进行关联分析，其中BrSF6-2025的显著性水平最高；3)利用该分子标记对种质资源群体中粒重极端的品系进行了验证。本发明专利技术为油菜粒重的分子育种提供了一种新的遗传标记，也为甘蓝型油菜粒重基因位点的图位克隆提供了有用信息。

【技术实现步骤摘要】
一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记及制备方法和应用
本专利技术属于油菜分子育种和生物
，更具体涉及一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记，还涉及一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记的制备方法，还涉及一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记在油菜高产育种中的应用。
技术介绍
油菜是最重要的油菜和能源作物之一，其脂肪酸碳链长度和结构接近化石柴油，是一种适宜于生产生物柴油的植物油。在当前和今后相当长的时间内，全世界都将要面临食用植物油和化石能源短缺的严峻局面，因此大幅度增加菜籽油供应总量，是保障全球食物和能源安全的重大需求。在城市化规模持续扩大耕地面积进一步缩小的形式下，持续提高单位面积产油量(＝单产×含油量)是唯一出路。近年来，高含油量品种选育已取得了重大突破，某些代表性品种(如中双11号等)的含油量已接近甚至超过50％，这已越来越接近油菜种质资源的最高含油量，这预示着高含油量育种即将遭遇瓶颈。与此相反，油菜单产提高的潜力还很大，这具体表现在各国参加油菜品种产量构成因子的平均值跟油菜种质资源的最高水平相比还有相当差距。例如，我国2000-2009年冬油菜四大区参试油菜品种平均千粒重在4克以下(俞琦英etal.2010)，而油菜种质资源中的最高千粒重超过了8克，并且参试油菜品种千粒重与单株产量的相关性很高，达0.5303。虽然油菜单株产量的三个构成因子之间表现不同程度的负相关，但其相关系数往往不大(SHIetal.2009)，这表明可以通过提高单个产量构成因子(如粒重)来增加产量。油菜粒重是典型的数量性状，其遗传力很高(SHIetal.2009；ZHANGandZHOU2006)。随着分子标记技术的发展，利用连锁分析的方法目前已定位了一些油菜粒重的数量性状位点(BASUNANDAetal.2010；FANetal.2010；QUIJADAetal.2006；RADOEVetal.2008；SHIetal.2009；UDALLetal.2006；YANGetal.2012；ZHANGetal.2011)，然而传统的连锁分析基于双亲本杂交构建的群体，遗传差异和遗传重组都很有限，因而QTL定位区间往往较大(10-20cM)难以找到紧密连锁的分子标记。近年来，随着各物种基因组信息的不断丰富，生物统计学和生物信息学的发展完善，关联分析逐渐成为植物数量性状基因定位和优良等位基因发掘的重要手段。关联分析能找到与目标性状紧密连锁的分子标记，并在具有广泛变异的自然群体中发掘对育种有利的等位基因，开发出优良等位基因的功能标记(YANetal.2009)。本研究通过关联分析制备到与油菜粒重性状高度连锁的分子标记，同时也加快了相关基因位点图位克隆的进程。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记，与甘蓝型油菜粒重高度关联的分子标记及用于甘蓝型油菜粒重性状的选育。本专利技术为油菜粒重育种提供新手段，加速油菜粒重性状改良进程，提高育种的准确性和选择效率。本专利技术的另一个目的在于提供了一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记的制备方法。本专利技术还有一个目的在于提供了一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记在油菜高产育种中的应用，以及该引物在甘蓝型油菜粒重基因图位克隆中的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术措施：一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记，其筛选过程如下：(1)搜集576份来自世界各个国家的甘蓝型油菜品种(LIetal.2014)作为油菜种质资源群体，并考察了两年的千粒重性状数据。(2)本实验室利用油菜测序品种中双11号和73290为亲本获得F2分离群体，构建了高密度的油菜遗传连锁图谱。在每条染色体上均匀的挑选单位点的SSR标记共91个，平均每条染色体上4.8个SSR标记。(3)采用CTAB法提取种质资源群体的叶片总DNA，过程中所用到的试剂包括提取液(1.4MNaCl，100mMTris,pH8.0，20mMEDTA,pH8.0，2％CTAB)、氯仿、异戊醇、无水乙醇。(4)利用(2)中91个SSR标记对种质资源群体进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对条带的大小进行判别，筛选多态性引物。(5)把(4)获得关联分析群体的基因型数据导入Structure2.3(http://pritch.bsd.uchicago.edu/structure.html)软件进行群体结构分析。(6)结合种质资源群体的千粒重表型数据、基因型数据和群体结构进行利用Tassel2.1(www.maizegenetics.net/tassel)软件进行关联分析。在p＝7.5E-4水平检测到1个与千粒重显著关联的标记位点BrSF7-181(此标记位于粒重QTL的峰值附近)，解释5.5％的表型变异。(7)据白菜(http://brassicadb.org/brad/)基因组序列在BrSF7-181附近开发SSR引物在种质资源群体中进行基因型分析。(8)再次利用Tassel2.1软件进行关联分析。在BrSF7-181附近又检测到4个与千粒重量极显著关联的标记位点(BrSF6-1572,BrSF6-2025,BnSF400-67,BrSF6-2389)，其中BrSF6-2025的显著水平最高(p＝1.5E-10)，解释9.4％的表型变异。利用上述技术措施，申请人最终获得了与油菜粒重性状关联标记BrSF6-2025。其引物序列是BrSF6-2025F:TTGTTCCTAACAAACGGAAAA,BrSF6-2025R:AAAAGAAACAGCCCAGCTCA。标记位点qBrSF6-2025的P值为1.5E-10，解释9.4％的表型变异。一种与油菜粒重性状高度关联的分子标记在油菜高产育种中的应用，其步骤如下：(1)挑选出576份品种资源中经多代自交已纯合的大粒和小粒材料，分析分子标记BrSF6-2025的基因型及其千粒重。(2)利用上述(1)分析结果根据分子标记BrSF6-2025的基因型对种质资源材料进行分类，并利用千粒重表型数据和公布的区试千粒重数据进行验证。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术的优点在于：本专利技术的与油菜粒重关联标记的制备方法与现有技术报道的不同。结合连锁定位和关联分析，最终制备了一个与粒重主效QTL更为高度紧密连锁的分子标记，提高了油菜高产育种的选择效率和准确率，从而加快育种进程。另外还可用于甘蓝型油菜粒重基因位点的图位克隆。附图说明图1本专利技术的技术流程图。图2利用分子标记BrSF6-2025的引物在部分种质资源中的基因组DNA中的扩增结果。具体实施方式实施例1：利用CTAB法提取叶片总DNA具体步骤如下：A.取0.1克新鲜叶片放入研磨，加700微升提取液研磨，随即转入1.5毫升离心管中置于65℃恒温水浴60分钟，其间混合2-3次；B.加等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1，V/V/V)，轻轻颠倒使其充分混匀，在12000rpm离心10分钟，轻轻吸取上清液转入另一1.5毫升离心管；加等体积的氯仿：异戊醇(24：1，V/V)重新抽提一次；C.加入1毫升-20℃预冷无水乙醇，置于-20℃冷冻不超过30分钟让DNA析出，12000rpm离心10分钟让DNA沉淀，倒掉离心管中乙醇溶液；用75％乙醇清洗2－本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记的引物，引物序列为：BrSF6‑2025F:TTGTTCCTAACAAACGGAAAA, BrSF6‑2025R: AAAAGAAACAGCCCAGCTCA。

【技术特征摘要】
1.一种与甘蓝型油菜粒重关联的分子标记的引物，引物序列为：BrSF6-2025F:TTGTTCCTAACAAACGGAAAA,BrSF6-2025R:AAAAGAAACAGCCCAGCTCA。2.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：王汉中，师家勤，李娜，刘贵华，王新发，杨庆，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42