本发明专利技术公开了一种用于区别检测禽类重要经济病毒的mRT‑PCR试剂盒及其应用，本发明专利技术的试剂盒中包括分别用于检测禽流感病毒M基因、禽流感病毒H7、H9、H5亚型、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒以及减蛋综合症病毒的引物对。使用本发明专利技术试剂盒检测禽流感病毒和呼吸道其他常见病毒具有灵敏度高、特异性强等特点，可即时检测和区别禽流感中重要、流行亚型和在国内最普遍流行的5种禽呼吸道病原，对人畜共患病控制、禽类混合感染监测和防控、养殖场生物安全、减少养殖业损失、食品安全和检疫等有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及可用于多种禽病毒检测的试剂盒，特别涉及一种用于区别检测禽类重 要经济病毒的mRT-PCR试剂盒及其应用，本专利技术属于病毒检测
技术介绍
禽流感(Avian influenza，AI)是全球性传播疾病，由正粘病毒科的禽流感病毒引 起，按病毒表面血凝素分类，已经发现有18个H亚型，按病毒神经氨酸酶分类已发现有10 个亚型。由于该两种蛋白存在高度变异，因此自然界中有许多不同种亚型的禽流感病毒。 许多禽流感病毒在禽的呼吸道、消化道定居引起轻微症状或无症状，但高致病性 禽流感H5、H7、H9亚型的病毒能够感染人类并致病。H5、H7、H9禽流感在禽类流行，H5、H7 亚型引起人的感染和死亡。禽流感和其他禽类呼吸道病毒混合感染，产生特征相似的临床 症状，例如禽流感病毒感染和传染性喉气管炎病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒感染 的临床特征难以区别，因此使病原分离和鉴别异常困难。 在中国禽类养殖中，传染性喉气管炎病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、传 染性法氏囊病毒、减蛋综合症病毒的流行率较为普遍。尽管有减毒和灭活疫苗上市控制流 行，但对于疾病防控检测和养殖企业的生物安全仍是不够的。通常病毒感染诊断采用病毒 分离、鉴别和血清学试验的方法，但这些方法费时耗力，特别是疫苗的大规模免疫使禽呼吸 道病原分离和鉴别异常困难。因此，有必要开发灵敏、特异、快速的诊断技术区分这6种病 原。 最近几年，核酸扩增技术如环介导等温扩增技术（LAMP)、重组酶复制酶扩增技术 (RPR)、实时RT-qPCR、多重RT-PCR(mRT-PCR)技术在病毒检测和诊断方面被广泛应用，其优 点在于一个反应就可检测多种微量的病原分子，快速，准确性高。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能够区别检测3种亚型禽流感病毒以及 在国内流行的其他禽常见呼吸道感染5种病原的试剂盒，同时建立一种使用该试剂盒进行 检测的方法。 为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段： 本专利技术的一种用于区别检测禽类重要经济病毒的mRT-PCR试剂盒，包括分别用于 检测禽流感病毒（Avian Influenza virus，AIV)M基因、禽流感病毒H7、H9、H5亚型、新城 疫病毒（Newcastle disease virus，NDV)、传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV)、传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV)、传染性 法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV)以及减蛋综合症病毒（Egg drop syndrome virus 76, EDS 76)的引物对； 其中，用于检测禽流感病毒M基因的引物对如下所示： M-WSN F :5，-GAA GGTAGATATTGAAAGATG-3，（SEQ ID NO. I) M-1023R :5' -GAA ACAAGGTAGTTTTTTACTC-3' （SEQ ID NO. 2) 其中，用于检测禽流感病毒H7亚型的引物对如下所示： H7-397F :5' -ACA TAC AGT GGG ATA AGA ACC-3' (SEQ ID NO. 3) H7-391R :5' -TCT CCT TGT GCA TTT TGA TGC C-3' (SEQ ID NO. 4) 其中，用于检测禽流感病毒H9亚型的引物对如下所示： H9-1F ：5' -AGC AAA AGC AGG GGA AYff W~3' (SEQ ID NO. 5) H9-808R :5，-CCA TAC CAT GGG GCA ATT AG-3' (SEQ ID NO. 6) 其中，用于检测禽流感病毒H5亚型的引物对如下所示： H5-1 :5' ACT ATG AAG AAT TGA AAC ACC T-3' (SEQ ID NO. 7) H5-2 :5' -GCAATGAAATTT CCA TTA CTCTC-3' (SEQ ID NO. 8) 其中，用于检测传染性支气管炎病毒的引物对如下所示： IBV-F :5' -GCT TTT GAG CCT AGC GTT-3，（SEQ ID NO. 9) IBV-R :5，-GCC ATG TTG TCA CTG TCT ATT-3，（SEQ ID NO. 10) 其中，用于检测新城疫病毒的引物对如下所示： NDV-F :5，-GCAGCTGCAGGGATTGGGT-3' (SEQ ID NO. 11) NDV-R :5，-TCTTTGAGCAGGAGGATGTTG-3，（SEQ ID NO. 12) 其中，用于检测传染性喉气管炎病毒的引物对如下所示： ILTV-F ：5' -ACG ATG ACT CCG ACT TTC-3r (SEQ ID NO. 13) ILTV-R :5，-CGT TGG AGG TAG GTG GTA-3，（SEQ ID NO. 14) 其中，用于检测传染性法氏囊病毒的引物对如下所示： VP2-F :5，-ACTGCCCAGAACCTACC-3，（SEQ ID NO. 15) VP2-R :5，-ACCRAGYCTCACATACC-3' (SEQ ID NO. 16) 其中，用于检测减蛋综合症病毒的引物对如下所示： Hexon-F -CAARTTCAGRCAGACGGT-Sr (SEQ ID NO. 17) Hexon-R :5，-TAGTGATGMCGSGACATCAT-3，（SEQ ID NO. 18) 〇 在本专利技术中，优选的，所述的试剂盒中还包括反应混合液，逆转录酶和Taq DNA多 聚酶混合液以及不含RNase的双蒸水。 使用本专利技术所述的试剂盒，用于区别和检测禽类重要经济病毒时需进行三次 mRT-PCR 反应： 第一次，称为三价mRT-PCR，使用检测禽流感病毒H7、H9、H5亚型的引物对，以待检 病毒DNA/RNA为模板，进行mRT-PCR扩增； 第二次，称为六价mRT-PCR，使用检测禽流感病毒M基因、新城疫病毒、传染性支气 管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒以及减蛋综合症病毒的引物对，以待检 病毒DNA/RNA为模板，进行mRT-PCR扩增； 第三次，称为八价mRT-PCR，使用检测禽流感病毒H7、H9、H5亚型、新城疫病毒、传 染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒以及减蛋综合症病毒的引物 对，以待检病毒DNA/RNA为模板，进行mRT-PCR扩增。 第一次mRT-PCR的反应DNA产物通过琼脂糖电泳观察包括300bp的H7扩增片段、 456bp的H5扩增片段、808bp的H9扩增片段。第二次mRT-PCR的反应DNA产物通过琼脂糖 电泳观察包括1个长约l〇23bp的禽流感病毒M基因扩增片段、149bp的IBV扩增片段、356bp 的NDV扩增片段、647bp的ILTV扩增片段、212bp的IBDV扩增片段以及897bp的EDS-76扩 增片段。第三次mRT-PCR的反应DNA产物通过琼脂糖电泳观察包括149bp的IBV扩增片段、 356bp ND本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于区别检测禽类重要经济病毒的mRT‑PCR试剂盒，其特征在于包括分别用于检测禽流感病毒(Avian Influenza virus，AIV)M基因、禽流感病毒H7、H9、H5亚型、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)、传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus，ILTV)、传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)以及减蛋综合症病毒(Egg drop syndrome virus 76，EDS 76)的引物对；其中，用于检测禽流感病毒M基因的引物对如下所示：M‑WSN F：5′‑GAA GGTAGATATTGAAAGATG‑3′M‑1023R：5′‑GAA ACAAGGTAGTTTTTTACTC‑3′其中，用于检测禽流感病毒H7亚型的引物对如下所示：H7‑397F：5′‑ACA TAC AGT GGG ATA AGA ACC‑3′H7‑391R：5′‑TCT CCT TGT GCA TTT TGA TGC C‑3′其中，用于检测禽流感病毒H9亚型的引物对如下所示：H9‑1F：5′‑AGC AAA AGC AGG GGA AYW WC‑3′H9‑808R：5′‑CCA TAC CAT GGG GCA ATT AG‑3′其中，用于检测禽流感病毒H5亚型的引物对如下所示：H5‑1：5′ACT ATG AAG AAT TGA AAC ACC T‑3′H5‑2：5′‑GCAATGAAATTT CCA TTA CTCTC‑3′其中，用于检测传染性支气管炎病毒的引物对如下所示：IBV‑F：5′‑GCT TTT GAG CCT AGC GTT‑3′IBV‑R：5′‑GCC ATG TTG TCA CTG TCT ATT‑3′其中，用于检测新城疫病毒的引物对如下所示：NDV‑F：5′‑GCAGCTGCAGGGATTGGGT‑3′NDV‑R：5′‑TCTTTGAGCAGGAGGATGTTG‑3′其中，用于检测传染性喉气管炎病毒的引物对如下所示：ILTV‑F：5′‑ACG ATG ACT CCG ACT TTC‑3′ILTV‑R：5′‑CGT TGG AGG TAG GTG GTA‑3′其中，用于检测传染性法氏囊病毒的引物对如下所示：VP2‑F：5′‑ACTGCCCAGAACCTACC‑3′VP2‑R：5′‑ACCRAGYCTCACATACC‑3′其中，用于检测减蛋综合症病毒的引物对如下所示：Hexon‑F：5′‑CAARTTCAGRCAGACGGT‑3′Hexon‑R：5′‑TAGTGATGMCGSGACATCAT‑3′。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张澍，吕宏亮，
申请(专利权)人：山西隆克尔生物制药有限公司，吕宏亮，张澍，
类型：发明
国别省市：山西;14
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