用于多基因捕获测序的探针制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于多基因捕获测序的探针制备方法，该方法至少包括如下步骤：步骤1：制备探针。步骤2：捕获目标DNA。步骤3：进行洗脱程序。步骤4：用高保真酶的反应扩增体系进行捕获目标DNA后扩增。步骤5：扩增产物用磁珠纯化后，用Nanodrop定量至20ng/ul，分装保存。步骤6：用Real-time PCR方法对阳性对照序列进行检测，验证捕获效率。本发明专利技术利用芯片技术合成了一种单链DNA捕获探针，包括DNA芯片合成，探针切割，核苷酸扩增，DAN解链得到单链的生物素标记的寡核苷酸探针池。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物
，尤其涉及一种用于多基因捕获测序的探针制备方 法。
技术介绍
近年来，以二代测序技术为基础的研宄得到快速发展，在二代测序
里，以 Illumina，Agilent，Roche，ABI为代表的第二代测序技术使测序成本大大降低，在临床和科 研中占据着重要地位。第二代测序技术最大的特点是高通量，可以对数以亿计的DNA片段 进行同时测序。尽管高通量的测序技术使测序成本大大降低，然而测序一个人的全基因组 仍需数千美元，这对于需要大量临床样本进行疾病研宄的项目来说，总测序成本仍然很高。 更重要的是全基因组测序的巨大数据量使得数据分析也是一个沉重的负担。而且目前全基 因组测序的深度一般为30X，很难达到一些临床应用的要求。对于研宄人类某些疾病的科 学家来说，他们并不需要对全基因组进行测序，他们感兴趣的往往只是小部分的基因组区 域，例如全外显子区（相当于1 %的人全基因组大小），而选择性对某些区域进行测序，不仅 使测序成本大大降低，同时也能缩短测序时间。序列捕获技术是一种对基因组特定区域进 行选择性富集的技术，将目标区域从基因组中分离出来，然后再对该目标区域进行测序，这 对于低成本地有针对性的进行基因组学研宄有非常重要的意义。 目前常用的序列捕获方法主要有，多重PCR，液相杂交法。PCR法具有高灵敏性、高 特异性和重复性好等优点。PCR富集法在二代测序技术平台目前主要用于捕获一些小的区 域，特别是一些连续的区域。对于较大的非连续的区域，如全外显子，PCR富集法的适用性受 到较大的限制。尽管微滴PCR等技术在一定程度上缓解了上述部分问题，然而实际上这些 PCR反应由于在同一反应中使用多种引物，导致大量非特异性产物的扩增，并且容易出现部 分区域无法扩增的情况，目前生产这类产品代表性的是ABI公司。 目前基于杂交的序列捕获技术是二代测序平台中使用较多的序列富集方法，主要 分为固相杂交和液相杂交。固相杂交序列捕获技术是一种将寡核苷酸探针合成在芯片上， 并在芯片上进行杂交的高通量序列捕获技术，可以在一个芯片上捕获整个外显子甚至更大 的区域。但因为芯片上的寡核苷酸量较少，所以就需要较大的样本起始量来推动杂交的发 生。而液相杂交技术是通过将芯片上合成的探针剪切回收后进行扩增富集而构建用于杂交 目的的杂交探针库，液相杂交在动力学上相对固相杂交更具优势，能降低对于样品起始量 的要求。相对于液相杂交而言，固相杂交已逐渐被淘汰，而液相杂交中的探针又可分为RNA 探针和DNA探针。目前有代表性的两家公司分别为Agilent和IDT, Agilent主要生产RNA 探针，而IDT主要生产DNA探针。RNA探针运输以及保存均不方便，相对于DNA来讲成本要 更高一些。而IDT的DNA探针的合成是通过柱式合成而后混合到一起的，而非芯片式合成 的，相对与全外显子的量，合成的的代价也是极其昂贵的，是极不易于推广的。虽然Agilent 和IDT的探针都是单链，相对杂交的驱动力来讲几乎是一致的，但它们都极其昂贵。
技术实现思路
本专利技术的目的：提供一种，包括捕获目标基 因的探针制备技术及其在二代测序中的应用。 为了实现上述目的，本专利技术的技术方案是： -种，该方法至少包括如下步骤： 步骤1 :制备探针。 步骤2 :捕获目标DNA。 步骤3 :进行洗脱程序。 步骤4 :用高保真酶的反应扩增体系进行捕获目标DNA后扩增。 步骤5 :扩增产物用磁珠纯化后，用Nanodrop定量至20ngAil，分装保存。 步骤6 :用Real-time PCR方法对阳性对照序列进行检测，验证捕获效率。 上述的，其中，在所述的步骤1中，至少包括 如下分步骤： 步骤1. 1 :合成12K，60K，90K等不同寡核苷酸数量的芯片，所述的芯片包含120bp 目标区域和通用的15个碱基末端： 5^ -ATCGCACCAGCGTGTN120CACTGCGGCTCCTCA-3'。 步骤1. 2 :把合成的寡核苷酸库溶于400ul的低浓度TE中。 步骤1. 3 :每个寡核苷酸的浓度为fmol级别，扩增得到所需浓度。 步骤1.4 :用4%胶跑PCR产物，然后回收150bp大小的PCR产物，溶解到100ul水 中。 步骤1. 5 :为了得到带生物素的单链的寡核苷酸片段，需要把PCR进行解链。 上述的，其中，在所述的步骤1. 3中， 引物序列具体为：A 5' Biotin-CTGGGAATCGCACCAGCGTGT-3'B 5， -CGTGGATGAGGAGCCGCAGTG-3，。 上述的，其中，在所述的步骤1. 3中，扩增条 件为：制备3个50ul PCR mix，模板分别为lul，2ul，5ul【主权项】1. 一种，其特征在于：该方法至少包括如下步 骤： 步骤1 ;制备换针； 步骤2 ;捕获目标DNA; 步骤3 ;进行洗脱程序； 步骤4 ;用高保真酶的反应扩增体系进行捕获目标DNA后扩增； 步骤5 ;扩增产物用磁珠纯化后，用Nano化op定量至20ng/ul，分装保存； 步骤6 ;用Real-timePCR方法对阳性对照序列进行检测，验证捕获效率。2. 根据权利要求1所述的，其特征在于；在所述 的步骤1中，至少包括如下分步骤： 步骤1. 1 ;合成12K，60K，90K等不同寡核巧酸数量的巧片，所述的巧片包含12化P目标 区域和通用的15个碱基末端： 5' -ATCGCACCAGCGTGTN120CACTGCGGCTCCTCA-3'; 步骤1. 2 ;把合成的寡核巧酸库溶于400ul的低浓度TE中； 步骤1. 3;每个寡核巧酸的浓度为fmol级别，扩增得到所需浓度； 步骤1. 4 ;用4%胶跑PCR产物，然后回收150bp大小的PCR产物，溶解到lOOul水中； 步骤1. 5;为了得到带生物素的单链的寡核巧酸片段，需要把PCR进行解链。3. 根据权利要求2所述的，其特征在于；在所述 的步骤1.3中， 引物序列具体为；A5'Biotin-CTGGGAATCGCACCAGCGTGT-3' B5' -CGTGGATGAGGAGCCGCAGTG-3'。4. 根据权利要求2所述的，其特征在于；在所述 的步骤1. 3中，扩增条件为：制备3个50ulPCRmix,模板分别为lul，化1，加1PCR反应条件如下。o5. 根据权利要求2所述的，其特征在于；在所述 的步骤1. 5中，还包括如下步骤： 步骤 1. 5. 1 ;用IXbindingbuffer漂洗lOOulDynabeadS? 3 次，悬浮 2Xbinding buffer,总体积是lOOul; 步骤1. 5. 2 ;把looul的Dynabeads⑥加入到looulPCR产物，祸旋震荡混匀，使用 移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温解育5分钟； 步骤1. 5. 3 ;将反应管短暂离屯、并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清5分钟， 移除上清； 步骤1. 5. 4 ;保持PCR管始终处于磁力架中，用IXTE清洗2次，移除上清； 步骤1. 5. 5 ;加入lOOul0. 1M的化0H，祸旋震荡混匀，使用移液器轻轻吹打10次充分 混匀，室温解育5分钟； 步骤1. 5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于多基因捕获测序的探针制备方法，其特征在于：该方法至少包括如下步骤：步骤1：制备探针；步骤2：捕获目标DNA；步骤3：进行洗脱程序；步骤4：用高保真酶的反应扩增体系进行捕获目标DNA后扩增；步骤5：扩增产物用磁珠纯化后，用Nanodrop定量至20ng/ul，分装保存；步骤6：用Real‑time PCR方法对阳性对照序列进行检测，验证捕获效率。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张道允，巩子英，
申请(专利权)人：上海允英医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31