一种水疱性病检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开一种可同时用于口蹄疫（A型、O型和Asia 1型）、猪水泡病和水疱性口炎检测的引物、由这些引物构成的试剂盒和制备方法，以及这种试剂盒非疾病诊断目的的使用方法。本发明专利技术的用于检测口蹄疫A型、O型和Asia 1型病毒的引物基因序列共10条，试剂盒中除主十条引物外还包括2条通用引物。相关实验表明本发明专利技术的敏感性高于普通荧光定量PCR技术，与荧光定量PCR相比可大大的节省时间，可以避免非特异性产物的扩增，同时有效地避免了引物的偏好向现象，提高了检测的灵敏性。

【技术实现步骤摘要】
一种水疱性病检测试剂盒
本专利技术涉及一种可用于对多种病原微生物进行检测的引物、由这些引物构成的试剂盒和制备方法，以及这种试剂盒非疾病诊断目的的使用方法，确切讲本专利技术涉及一种可同时用于口蹄疫（A型、O型和Asia1型）、猪水泡病和水疱性口炎检测的的引物、由这些引物构成的试剂盒和制备方法，以及这种试剂盒非疾病诊断目的的使用方法。
技术介绍
口蹄疫（Foot-and-Mouthdisease，FMD）是由小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒（Foot-and-Mouthdiseasevirus，FMDV）引起的一种偶蹄动物急性接触性传染病，有O型、A型、C型、SATⅠ型（南非Ⅰ型）、SATⅡ型（南非Ⅱ型）、SATⅢ型（南非Ⅲ型）、Asia1型（亚洲1型）等7个血清型。猪水疱病(Swinevesiculardisease,SVD)是由小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)猪水疱病病毒（SVDV）引起的一种急性接触性传染病。水疱性口炎（Vesicularstomatitis，VS）是由水疱性口炎病毒（Vesicularstomatitisvirus，VSV）引起的多种哺乳动物的一种急性、高度接触性传染病，以马、牛、猪等动物较易感染，绵羊和山羊也可感染。这三种疾病能引起严重的经济损失并导致世界肉类市场的混乱，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病，我国农业部将其列为一类动物疾病。然而，这三种病毒感染的动物均以舌、唇、口腔黏膜、乳头和蹄冠等处上皮发生水疱为主要特征，在临床症状上很难进行区分。快速和可靠的诊断对于这三种疾病的控制和消灭至关重要，而且对肉食品中低含量的病毒、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测的方法，必须具备高敏感性、高特异性和高准确性。常规的诊断方法如病毒分离、血清学试验、动物试验等，或费时费力，或特异性和敏感性不高，不能满足快速、准确诊断的要求。现有的RT-PCR、竞争PCR和ELISA-PCR方法克服了这些方法的不足，可用于这三种疾病的诊断，但也有费时、易污染和每次检测的样品数量少等缺点。由于快速鉴别诊断结果有利于特定型疫苗的选择和控制疫病蔓延，增强预防措施的有效性和实效性。
技术实现思路
本专利技术提供一种可克服现有技术不足的同时用于分型鉴别检测口蹄疫A型、O型和Asia1型病毒、水疱性口炎病毒和猪水泡病病毒的技术，具体讲是联合使用可用于检测口蹄疫A型、O型和Asia1型病毒、水疱性口炎病毒和猪水泡病病毒的引物，包括有这种引物的检测试剂盒，及其制备方法和这种试剂盒非疾病诊断目的的使用方法。本专利技术的用于检测口蹄疫A型、O型和Asia1型病毒的引物基因序列共10条，分别为：SEQIDNo.1，可特异性扩增口蹄疫A型病毒核酸的上游引物：AGGTGACACTATAGAATAGGGTGATCTAGGGTCTCTCGC，在本专利技术中被命名为FMDV-A-F；SEQIDNo.2，可特异性扩增口蹄疫A型病毒核酸的下游引物GTACGACTCACTATAGGGACAGGAGCTGCTTTGCAGGTGCAAT，在本专利技术中被命名为FMDV-A-R；SEQIDNo.3，可特异性扩增口蹄疫O型病毒核酸的上游引物：AGGTGACACTATAGAATAGTGACTGAACTGCTTTACCGCAT，在本专利技术中被命名为FMDV-O-F；SEQIDNo.4，可特异性扩增口蹄疫O型病毒核酸的下游引物：GTACGACTCACTATAGGGAGACATGTCCTCCTGCATCTG，在本专利技术中被命名为FMDV-O-R；SEQIDNo.5，可特异性扩增口蹄疫Asia1型病毒核酸的上游引物：AGGTGACACTATAGAATAACTGCCTACCAGAAGCAACC；在本专利技术中被命名为FMDV-Asia1-F；SEQIDNo.6，可特异性扩增口蹄疫Asia1型病毒核酸的下游引物：GTACGACTCACTATAGGGAAGTATGTCTCCGCACGCTTC，在本专利技术中被命名为FMDV-Asia1-R。SEQIDNo.7，可特异性扩增水疱性口炎病毒病毒核酸的上游引物：AGGTGACACTATAGAATATGATACAGTACAATTATTTTGGGA，在本专利技术中被命名为VSV-F；SEQIDNo.8，可特异性扩增水疱性口炎病毒病毒核酸的下游引物：GTACGACTCACTATAGGGAGAGACTTTCTGTTAGGGATCTGG，在本专利技术中被命名为VSV-R。SEQIDNo.9，可特异性检测猪水泡病病毒的核酸的上游序列为：AGGTGACACTATAGAATATTCAGAATGATTGCATATGGGG，在本专利技术中被命名为SVDV-F；SEQIDNo.10，可特异性扩增猪水泡病病毒核酸的下游引物GTACGACTCACTATAGGGATCACGTTTGTCCAGGTTACC，在本专利技术中被命名为SVDV-R。除以上引物外，本专利技术还公开两条通用引物：SEQIDNo.11，通用上游引物：AGGTGACACTATAGAATA，在本专利技术中被命名为UWD-F；和SEQIDNo.12，通用下游引物：GTACGACTCACTATAGGGA，本专利技术中被命名为UEV-R。本专利技术的口蹄疫A型、O型和Asia1型病毒的检测试剂盒中包括有前述的12条可用于GeXP多重基因分析系统的扩增引物SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、IDNo.9、SEQIDNo.10、SEQIDNo.11和SEQIDNo.12，其中SEQIDNo.11的5’端添加有Cy5荧光标签。本专利技术的试剂盒非疾病诊断的使用方法是以被检样品的RNA为模板，用引物SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9、SEQIDNo.10、SEQIDNo.11和SEQIDNo.12进行扩增，扩增产物进行毛细管电泳分析，根据毛细管电泳信号分析图中241bp处是否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样品的口蹄疫病毒A型阴阳性；根据毛细管电泳信号分析图中280bp处是否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样品的口蹄疫病毒Asia1型型阴阳性；根据毛细管电泳信号分析图中287bp处是否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样品的口蹄疫病毒O型阴阳性。根据毛细管电泳信号分析图中268bp处是否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样品的水疱性口炎病毒阴阳性；根据毛细管电泳信号分析图中196bp处是否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样品的猪水泡病病毒阴阳性。根据相关实验，本专利技术的口蹄疫（A型、O型和Asia1型）、猪水泡病和水疱性口炎检测试剂盒内放置的特异性嵌合引物和通用引物的最佳比例为：特异性嵌合引物：通用引物等于1：10。为方便本专利技术的试剂盒的使用，本专利技术的口蹄疫（A型、O型和Asia1型）、猪水泡病和水疱性口炎检测试剂盒内还有甲酰胺溶液、分离缓冲液、分离胶、病毒RNA、PrimrScriptOne本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测口蹄疫A型、O型、Asia 1型病毒、水疱性口炎病毒和猪水泡病病毒的引物序列，其共10条，引物基因序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、 SEQ ID No.5和SEQ ID No. 6、SEQ ID No.7 、SEQ ID No8、SEQ ID No9和SEQ ID No10。

【技术特征摘要】
1.用于检测口蹄疫A型、O型、Asia1型病毒、水疱性口炎病毒和猪水泡病病毒的引物序列，共10条，引物基因序列为SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5和SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9和SEQIDNo.10。2.一种口蹄疫A型、O型和Asia1型病毒的检测试剂盒，其特征在于试剂盒中包括有用于GeXP多重基因分析系统的扩增10引物：SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9、SEQIDNo.10，还包括通用引物：SEQIDNo.11和SEQIDNo.12，其中SEQIDNo.11的5’端添加有Cy5荧光标签。3.权利要求2所述试剂盒非疾病诊断的使用方法，其特征在于以被检样品...

【专利技术属性】
技术研发人员：张强，卢昌，赵志荀，吴国华，颜新敏，李应国，岳华，周晓黎，李健，朱海霞，代雪玲，田波，芦晓立，高顺平，王曼，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62