本发明专利技术公开了一种循环肿瘤DNA EGFR检测技术及其试剂盒，包括如下步骤：步骤1：针对突变位点设计合成引物、封闭探针和检测探针。步骤2：样本处理与DNA的提取。步骤3：所述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术应用于试剂盒中，建立PCR扩增反应体系。本发明专利技术采用了特异的MGB Blocker探针，EGFR特异探针和引物，可以检测循环肿瘤DNA中EGFR的突变；利用MGB Blocker阻滞了EGFR野生型基因组非特异性的扩增，提高了其灵敏度；可以在循环肿瘤DNA中检测EGFR的突变；操作简单，检测廉价，可以大规模推广；检测速度快，检测过程大约需要2小时就可完成。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种循环肿瘤DNA EGFR检测技术及其试剂 盒。
技术介绍
表皮生长因子受体（EGFR)是人表皮生长因子受体（HER)家族成员，属于受体酪氨 酸激酶家族，是原癌基因c-erbBl的表达产物。EGFR主要位于细胞膜，被EGF等配体激活后 发生二聚化并引发细胞内段磷酸化，产生酪氨酸激酶活性，进一步激活下游信号通路（Pao W et al.Proc Natl Acad Sci U S A. 2004; 101:13306-11)，调节细胞生长、增殖等多种生 理过程。EGFR下游信号通路主要有：Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK通路、PI3K/roKl/Akt通路、 PLC-y 通路、JAK/STAT 通路等（Sun J M et al. Lung Cancer. 2010;68:427-32)。 许多实体瘤均存在EGFR信号通路相关基因体细胞突变或表达异常，与肿瘤生长、 侵袭和转移密切相关。EGFR信号通路重要靶标的检测及靶向治疗一直是国际肿瘤个体化医 疗领域关注的焦点。 基于EGFR在肿瘤细胞中异常的特点，目前已开发出多种EGFR靶向药物。比如作 用于EGFR激酶区的小分子酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI)，如吉非替尼（Gefitinib)、厄洛 替尼（Erlotinib)和埃克替尼（Icotinib);作用于EGFR胞外域部分的单克隆抗体，如西妥 昔单抗（Cetuximab)、帕尼单抗（Vectibix)。 常用的EGFR-TKI包括吉非替尼、厄洛替尼和埃克替尼，是目前非小细胞肺癌患 者最有效的靶向药物。但是，EGFR-TKI并非对所有的患者都有效。EGFR外显子18、19、21 发生突变的患者、吉非替尼有效率可达80%，而野生型患者基本无效。EGFR突变是药物 有效性的前提（Sequist L V et al.J Clin Oncol. 2008;26:2442-9, Yang C H et al.J Clin Oncol. 2008 ；26:2745-53, Suda K et al. J Thorac Oncol. 2009 ；4:1-4, Costa D B et al, Clin Cancer Res. 2008;14:7060-7)。但部分EGFR-TKI初始有效的患者后期会发生耐 药、与EGFR外显子20发生突变密切相关。以非小细胞肺癌为例，EGFR外显子20突变发生 率为1. 6%，约占EGFR突变率的9%，50%的EGFR-TKI耐药由EGFR外显子20的p. I790M 点突变所致（Suda K et al.J Thorac Oncol. 2009 ;4:1-4, Costa D B et al, Clin Cancer Res. 2008 ； 14:7060-7, Gazdar A F. Oncogene. 2009 ；28Suppl l:S24-31.)〇 EGFR 突变和 EGFR-TKI 的治疗效果密切相关（Sequist L V et al.J Clin Oncol. 2008；26:2442-9, Yang C H et al.J Clin Oncol. 2008 ；26:2745-53, Suda K et al.J Thorac Oncol. 2009；4:1-4, Costa D B et al,Clin Cancer Res. 2008； 14:7060-7,Gazdar A F.0ncogene.2009;28Suppl 1:S24-31.)，因此，EGFR 的突变检测对 于癌症的EGFR-TKI个体化治疗具有重要的意义。目前常用的EGFR突变检测有测序法、 PCR-SSCP、ARMS、数字 PCR 以及 NGS 等。 目前，EGFR突变检测都是基于肿瘤组织样本的，这样存在两个问题，一，肿瘤组织 大都来源于活检技术即穿刺和活检钳活检，这样会给病人带来极大的痛苦，是有创检测。 二，对于某些晚期的病人，不能穿刺或者手术，病人样本就很难获取，因此就很难根据检测 的结果对病人进行靶向用药。临床上迫切需要一种能够替代肿瘤组织的样本来对病人进行 个性化指导用药。 循环肿瘤DNA是指肿瘤患者外周血循环中存在较高水平的DNA。浸润性肿瘤患者 外周血中DNA含量更高。这些DNA来源于肿瘤细胞，具有和肿瘤组织DNA拥有相似的遗传 学和表观遗传学改变，与肿瘤的发生、发展和转移存在很大的关系，因此表现出其对肿瘤的 早期诊断、鉴别、分期、预后和治疗检测方面具有重要意义（Bettegowda C et al.2014Sci. Transl Med 224:224ra24)〇 循环肿瘤DNA虽然是一种很好的肿瘤组织替代样本，但是，由于循环肿瘤DNA含 量稀少，检测循环肿瘤DNA需要极灵敏的技术。BEAMing扩增法的应用使得DNA检测技术 灵敏度大大提高。2007年，该技术的开发者美国约翰霍普金斯大学的Bert Vogelstein和 Kenneth Kinzler对18名结直肠癌患者的循环肿瘤DNA进行了跟踪。研宄显示，术后仍 能检测到循环肿瘤DNA的患者，基本上都出现了复发，术后未检测到循环肿瘤DNA的患者， 结直肠癌无复发，显示了循环肿瘤DNA良好地临床应用前景（Luis A et al.2012Nature 7404:537-540)。BEAMing技术的灵敏度高，可以达到0. 1% -0. 01%，是一种比较理想的循 环肿瘤DNA检测技术（Frank D et al 2006Nature Method 551-559)。但是由于其操作 复杂，仪器昂贵，不适用于大规模临床推广。数字PCR是近年来出现的另一种高灵敏度检 测的技术，这种技术最高也能达到〇. 01 %的灵敏度，但是这种技术极易产生假阳性的结果 (Pinheiro LB et al.2012Anal Chem;84(2):1003 - 1011)。同样，高昂的设备和试剂价格、 极高的实验操作要求也同样限制了其大规模推广。
技术实现思路
本专利技术的目的：提供一种循环肿瘤DNA EGFR检测技术及其试剂盒，灵敏度极高， 平均达到0. 1 % -0. 01 %的水平，特别适合检测稀有突变；利用此稀有突变的检测方法，检 测循环肿瘤DNA中EGFR的突变，并形成试剂盒，为广大的肿瘤患者服务。 为了实现上述目的，本专利技术的技术方案是： 一种循环肿瘤DNA EGFR检测技术，包括如下步骤： 步骤1 :针对突变位点设计合成引物、封闭探针和检测探针。 步骤2 :样本处理与DNA的提取。 步骤3 :所述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术应用于试剂盒中，建立PCR扩增反应 体系。 上述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术，其中，在所述的步骤2中，提取的所述的样本 适用于病人血浆中的循环肿瘤DNA或石蜡切片组织。 上述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术，其中，在所述的步骤3中，所述的PCR扩增反 应体系包括：【主权项】1. 一种循环肿瘤DNA EGFR检测技术，其特征在于：包括如下步骤： 步骤1 :针对突变位点设计合成引物、封闭探针和检测探针； 步骤2 :样本处理与DNA的提取；本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种循环肿瘤DNA EGFR检测技术，其特征在于：包括如下步骤：步骤1：针对突变位点设计合成引物、封闭探针和检测探针；步骤2：样本处理与DNA的提取；步骤3：所述的循环肿瘤DNA EGFR检测技术应用于试剂盒中，建立PCR扩增反应体系。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张道允，巩子英，
申请(专利权)人：上海允英医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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