检测细胞外基质MMP13的BRET探针、基因、表达载体和构建方法技术

本发明专利技术提供了一种检测细胞外基质MMP13的BRET探针，包括BRET生物发光供体和BRET受体荧光蛋白，以及连接BRET生物发光供体和BRET受体荧光蛋白的MMP13特异性识别降解的多肽底物；BRET生物发光供体为具有序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的海肾的荧光素酶(Rluc8)，BRET受体荧光蛋白为黄色荧光蛋白。本发明专利技术构建的探针，自身的供体和受体蛋白之间通过可被MMP13特异性识别降解多肽底物连接产生BRET，当多肽底物被MMP13特异性识别降解之后，BRET现象消失，只能检测到生物发光供体发出的发射光，而不能检测到荧光蛋白的发射光；并且Rluc8蛋白的C端融合了含有血小板源生长因子受体的跨膜区域，因此能锚定在细胞膜的表面，可以在不损伤细胞的情况下进行活细胞外基质金属蛋白酶的检测，同时还具有更高的灵敏度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种检测细胞外基质MMP13的BRET探 针、基因、表达载体和构建方法。
技术介绍
基质金属蛋白酶（Matrixmetalloproteinases，MMPs)是一组依赖Zn2+依赖的 细胞外酶，广泛存在于各结缔组织中，在细胞外基质的降解中起重要作用。其中，MMP13又 称为胶原酶-3,它是基质金属蛋白酶（MMPs)家族中重要的降解酶，能够特异性地降解胶原 分子中三维螺旋结构的酶，其对于H型胶原的降解效率是所有基质蛋白酶中最高的。MMP13主要由滑膜细胞、软骨细胞、中性粒细胞等产生，主要通过破坏H型胶原之 间的肽链而达到裂解软骨的目的，因此在软骨中MMP13表达水平升高是导致骨关节炎（OA) 节软骨退变的主要因素之一。并且进一步在反复的验证之后，骨关节炎患者中MMP13蛋白 比正常人高十倍，且表达量随着骨性关节炎的进展而逐渐增加，MMP13逐渐成为OA诊断和 治疗的一项生理性指标，并且可能为OA的治疗提供一个新的靶点。 而现有的MMP13的检测方法，最常用的是双抗体夹心法测定，受限于抗体的特异 结合性以及检测灵敏度的限制，且操作步骤过程繁琐，并且无法检测到活性MMP13的含量； 并且检测的过程中都需要损伤细胞，不适用于活体的蛋白酶的实时动态监测。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种能够在真核细胞膜 表面表达的用于检测细胞外基质MMP13的BRET探针、基因、表达载体和构建方法。 为了实现上述专利技术目的，本专利技术实施例的技术方案如下： 一种检测细胞外基质MMP13的BRET探针，包括BRET生物发光供体和BRET受体荧 光蛋白，所述BRET生物发光供体和BRET受体荧光蛋白之间通过MMP13特异性识别降解的 多肽底物连接； 其中，所述BRET生物发光供体为具有序列表SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的Rluc8 蛋白，所述BRET受体荧光蛋白为黄色荧光蛋白。 本专利技术构建的上述探针，探针自身的供体和受体荧光蛋白之间通过一可被MMP13 特异性识别降解多肽底物连接产生BRET，当多肽底物被MMP13特异性识别降解之后，BRET 现象消失，只能检测到供体蛋白底物发出的发射光产生荧光信号变化，从而实现检测目的； 并且RlucS蛋白的C端融合了含有血小板源生长因子受体（PDGFR)的跨膜区域，因此能锚 定在细胞膜的表面，从而可以在不损伤细胞的情况下进行活体检测，同时还具有更高的灵 敏度。 本专利技术进一步还提出编码上述检测细胞外基质MMP13的BRET探针的基因，以及该 编码基因在真核细胞内进行表达的表达载体；其中， 编码基因包括顺次连接的BRET生物发光供体编码基因、MMP13特异性识别降解的 多肽底物编码基因和BRET受体荧光蛋白编码基因；所述BRET生物发光供体编码基因为具 有序列表SEQ.ID.No. 3碱基序列的Rluc8蛋白编码基因。 针对本专利技术中真核表达载体的实施，本专利技术进一步还提出上述表达载体的构建方 法，包括如下步骤： 将具有序列表SEQ.ID.No. 3的碱基序列的Rluc8蛋白编码基因克隆至质粒 pDisplay的多克隆位点，得到Rluc8表达质粒； 将黄色荧光蛋白的编码基因克隆至所述Rluc8表达质粒中与Rluc8蛋白编码基因 末端衔接，形成荧光融合体表达质粒； 将具有序列表SEQ.ID.No. 4碱基序列的多肽底物编码基因插入至所述融合体表 达质粒中RlucS蛋白编码基因和黄色荧光蛋白的编码基因之间。【附图说明】 下面将结合附图及实施例对本专利技术作进一步说明，附图中： 图1为本专利技术实施例用于检测细胞外基质的MMP13的BRET探针示意图； 图2为图1的BRET探针中多肽底物被MMP13特异性识别降解BRET小时示意图； 图3为本专利技术实施例质粒pDisplay克隆Rluc8蛋白编码基因后的质粒图谱； 图4为图3中质粒进一步克隆黄色荧光蛋白编码基因后的质粒图谱； 图5为图4中质粒进一步插入多肽底物编码基因后的质粒图谱； 图6为激光共聚焦显微镜下的细胞膜表面、单独的BRET探针和BRET探针结合表 达定位于细胞膜上的荧光对照图； 图7为BRET探针转染后，加入不同MMP13浓度处理后软骨细胞后荧光结果对照 图； 图8为采用FACS流式细胞仪用BRET探针检测MMP13活性中荧光位移发生改变产 生的荧光强度发生的位移改变。【具体实施方式】 为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不 用于限定本专利技术。 本专利技术实施例提供一种用于检测细胞外基质的MMP13的BRET探针，其示意图可以 参见图1所示；包括BRET生物发光供体1和BRET受体荧光蛋白2,且BRET生物发光供体1 和BRET受体荧光蛋白2之间通过MMP13特异性识别降解多肽底物3连接； 其中BRET生物发光供体为具有序列表SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的Rluc8蛋白； BRET受体荧光蛋白为黄色荧光蛋白。 本专利技术构建的上述探针，基于生物发光共振能量转移（BRET)机理进行，BRET本身 是一种非辐射的能量从供体传递到受体的转移过程；BRET需要由两个融合蛋白组成，一个 融合是提供能量的荧光素酶，另外一个融合能量接受能量的受体荧光蛋白，荧光素酶可以 由具有疏水性和膜渗透性的腔肠素来激活产生；当两个融合蛋白发生相互作用，并且距离 小于10nm，供体便会将自身发出能量转移到受体；如果这两种整合蛋白被剪切分离至距离 超过上述lOnm，如图2所示，则相互之间的BRET现象消失，不会发生作用，就仅仅只能检测 到供体蛋白底物发出的发射光。 在本专利技术中，利用BRET的构建探针，将改造后的Rluc8蛋白（海肾荧光素酶突变 体）作为供体，同时以黄色荧光蛋白作为受体，使供体荧光素酶的发射光谱和受体蛋白激 发光谱间的重叠，增强BRET信号强度；同时采用MMP13特异性识别降解多肽底物将供体和 受体连接，使其产生BRET;并且当多肽底物被MMP13特异性识别降解后，BRET消失产生荧光 变化，根据荧光的变化情况即可计算得到MMP13的表达水平。 同时在上述采用真核细胞表面展示荧光素酶BRET作为检测蛋白酶所引起BRET信 号构建的BRET探针，本专利技术中采用的上述RlucS蛋白的C端融合了含有血小板源生长因子 受体（PDGFR)的跨膜区域，因此它真核表达的蛋白能锚定在细胞膜的表面，从而可以在不 损伤细胞的情况下进行活体的检测。 并且本专利技术中构建的上述BRET探针和FRET不同，其供体不需要外源光的活化，直 接加入底物便可以激活，这样可以避免了供体的光漂白和细胞自发荧光的问题，因此在测 定中不需要进行BRET的背景扣除；相比具有更高的灵敏度以及极低的内源背景。 进一步在上述实施方式中，本申请中的MMP13特异性识别降解多肽底物，基于上 述供体和受体距离小于IOnm的要求，因此通常采用长度较小的寡肽链，并且基于特异针 对MMP13的作用的识别降解序列位点进行设计，多肽底物采用具有序列表SEQ.ID.No. 2氨 基酸序列的多肽序列，从序列表中可以看出，多肽底物的氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测细胞外基质MMP13的BRET探针，包括BRET生物发光供体和BRET受体荧光蛋白，其特征在于，所述BRET生物发光供体和BRET受体荧光蛋白之间通过MMP13特异性识别降解的多肽底物连接；其中，所述BRET生物发光供体为具有序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的Rluc8蛋白，所述BRET受体荧光蛋白为黄色荧光蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王大平，梁宇杰，段莉，李子刚，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：广东;44