本发明专利技术提供一种Retroactive基因及其dsRNA在害虫防治中的应用。具体为从飞蝗转录组数据库中搜索获得Retroactive基因片段，对其进行全长克隆，测序后获得Retroactive基因全长cDNA序列，其核苷酸及其编码的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，进一步设计核苷酸序列为SEQ ID NO：7的片段合成相应dsRNA，并将其注射进入飞蝗体腔中，飞蝗出现无法蜕去旧表皮最终死亡，致死率达到91.2％。由于其高效的致死率，为害虫防治提供新的分子靶标位点，对于害虫有效控制具有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及飞幢Retroactive基因及其dsRNA在害虫防 治中的应用。
技术介绍
飞蝗是我国历史上重要的农业害虫，蝗灾暴发对农业生产构成极大威胁。目前对 其防治主要依靠化学杀虫剂。传统的化学防治方法不仅污染农业生态环境，同时对天敌及 高等动物等非靶标生物为害严重，因此，研发害虫绿色防控新技术已成为农业科技工作者 的重要课题。 RNA干扰（RNAi)是一种由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默现象，RNAi 技术自2006年获得诺贝尔奖以来，一直是生物科学领域的前沿热点。该技术不仅为基因 功能研宄提供了实质性的技术突破，而且在农业害虫防治方面也具有极大的应用潜力。与 传统的化学防治相比较，基于RNAi技术的害虫防治方法具有独特的优势：由于dsRNA只作 用于特定的靶标序列，对非靶标生物无影响；RNA在自然界中容易降解，所以不存在残留问 题，环境安全性好。因此RNAi技术是未来植物保护领域害虫生物防治的重要发展方向。 表皮在昆虫生长发育中起着重要的作用，几丁质是表皮的主要成分。表皮几丁质 的有序排列是保证昆虫表皮发挥正常生理功能的保障。由于人和其他高等动物体内没有几 丁质，针对几丁质筛选的分子靶标用于害虫防治相对安全。Rtv基因负责昆虫表皮几丁质有 序排列，因此，本专利技术基于RNAi筛选获得的Rtv基因为害虫防治提供了一种环境友好的新 型害虫防治分子靶标和基于RNAi技术的害虫防治新方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种飞蝗Rtv基因和合成的dsRNA的方法以及合成dsRNA 在害虫防治中的应用。 本专利技术提供一种飞蝗Rtv基因，其核苷酸序列为SEQ IDNO :1所示的序列。该基 因核苷酸序列的获得是采用GeneDoc软件对从飞蝗转录组数据库中搜索获得的片段进行 拼接和比对，基于搜索获得的片段，采用primer premier5. 0软件分别设计上游引物SEQ ID N0:3和下游引物SEQ IDN0:4,并将其送往公司合成。采用PCR扩增获得一条长度为482bp 的片段，经过试剂盒纯化后的PCR产物与T3载体连接，后转入感受态细胞中培养，挑取白斑 在含有氨苄霉素抗性的LB液体培养基中培养12h后进行菌液检测，将检测含有目的条带的 菌液分出200 y 1送入公司测序，剩下的菌液用于提取质粒并保存于-80°C超低温冰箱中。 测序获得Rtv基因的全长序列为482bp，其核苷酸序列为SEQ IDNO :1所示。 本专利技术提供一种飞蝗Rtv基因编码的氨基酸序列，其特征是SEQ IDNO :2所示的 序列。该氨基酸序列的获得是采用ExPaSy在线软件将SEQ IDNO: 1翻译为相应的氨基酸， 并对相对分子量和等电点进行预测。预测结果表明Rtv基因编码153个氨基酸，相对分子 量为17KD，理论等电点为6. 55。 本专利技术提供飞蝗Rtv基因片段dsRNA的合成方法及其在害虫防治中的应用：基 于Rtv基因SEQ ID NO :1序列，采用primer premier5. 0软件设id对含有17启动子的 引物，上游引物和下游引物分别如SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示，PCR扩增获得一段 长度为416bp的两端均为17启动子的DNA片段，其核苷酸序列为SEQ ID N0:7所示的 序列。试剂盒纯化的PCR产物做为模板用于合成dsRNA，采用I7RiboMAXTMExpress RNAi System(Promega)试剂盒体外转录合成dsRNA。使用微量进样器将合成的dsRNA注射进入 飞蝗体腔内，检测dsRNA对Rtv基因表达的影响，并观察dsRNA对飞蝗蜕皮发育的影响。结 果表明，dsRNA降低飞蝗Rtv基因的mRNA表达，同时dsRNA影响飞蝗正常蜕皮，使飞蝗出现 蜕皮困难从而难以到达下一龄期。dsRNA对飞蝗具有致死效应。 飞蝗Rtv基因片段合成的dsRNA对飞蝗致死原因研宄：将Rtv基因合成的dsRNA 注射进入飞蝗体腔中，将其表皮解剖下来，并对表皮进行透射电镜观察，注射合成dsRNA飞 蝗组的表皮几丁质致密排列的层状结构消失。 本专利技术的有益效果：针对飞蝗Rtv基因片段合成的dsRNA对飞蝗具有致死的作用， 表现为注射特异性dsRNA的飞蝗出现翅芽张开、但虫体难以摆脱旧表皮的束缚，最终背部 弓起并死亡。死亡率达到91. 2%。本专利技术基于飞蝗Rtv合成特异性的dsRNA对飞蝗高致死 性的特点为筛选高效分子靶标提供便利，可为害虫防治提供新型绿色环保的方法。【附图说明】 图1 :飞蝗Rtv基因全长克隆的PCR扩增检测（1所示为DL5000DNA Marker，条带 大小从下到上依次为 100、250、500、750、1000、1500,2000、3000、5000bp，2 所示为 Rtv 基因 cDNA条带） 图2 :dsRNA对飞蝗Rtv基因表达影响（1为注射dsGFP的对照组，2为注射dsRNA 的处理组）。0-actin为内参基因。其中*P〈0. 05，#P〈0. 01。 图3 :dsRNA对5龄飞蝗若虫蜕皮发育的影响（1为注射dsGFP的对照组，2和3均 为注射dsRNA的处理组）。处理组飞蝗出现翅芽张开、但虫体难以摆脱旧表皮的束缚，最终 背部弓起并死亡。 图4 :dsRNA对飞蝗表皮几丁质超微结构影响。实验组飞蝗表皮几丁质致密排列的 层状结构消失。【具体实施方式】 实施例1:飞蝗Rtv基因全长cDNA序列及编码氨基酸 1.飞蝗Rtv基因搜索 采用生物信息学方法从飞蝗的转录组数据库中对Rtv基因进行搜索，使用NCBI数 据库的Blastx进行同源性分析，确定筛选获得1条飞蝗Rtv基因全长序列。 2.飞幢Rtv基因全长cDNA验证 基于上述的飞幢Rtv基因的全长序列，采用primer premier5. 0软件设id段引 物用于全长克隆。其中上游引物CGTATGTCACAGTTACCATGAAAATC(SEQ ID N0:3)和下游引物 TTATCAGTTCACAAGCCAGTCTCC(SEQ N0:4)。引物合成由上海英潍捷基生物有限公司完成。 选取生长健康、大小一致的5龄飞蝗若虫，使用锋利的解剖刀和镊子将飞蝗的表 皮快速解剖下来并冻于液氮中保存。依照TaKaRaTrizol试剂盒将表皮中的RNA提取 出来。采用M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA，将其做为全长克隆所需模 板。通过PCR扩增和琼脂糖凝胶检测获得飞蝗Rtv基因的全长cDNA序列（图1)，采用 GelExtroactionKit(Omega)对扩增获得的PCR产物进行纯化并连接到pEASY_T3克隆载 体（全式金公司）上，当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种飞蝗Retroactive基因，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：于荣荣，张建珍，张敏，丁国伟，马恩波，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西;14
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