用于产生糖蛋白的组合物和方法技术

本公开内容涉及通过在相对于传统基本培养基具有增加的甘氨酸浓度的培养基中培养哺乳动物细胞来产生具有增加水平的非岩藻糖基化糖形的抗体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 1.序列表 本申请包括已通过EFS-Web以ASCII形式提交的序列表并将其通过引用整体并入 本文。所述ASCII副本创建于2013年9月24日，名称为381493-735TO(118134)_SL.txt， 并且其大小为42, 313字节。 2?背景 蛋白质通过糖基化的翻译后修饰导致不同糖形的形成，所述糖形常常具有独特的 性质。蛋白质糖基化的差异可对该蛋白质的物理和化学性质（包括该蛋白质对特定靶分子 的结合亲和力）具有显著的影响。已知若干种调节蛋白质糖基化的方法。不同的表达系统 可产生不同的糖基化模式。此外，蛋白编码序列可被修饰以产生具有升高或降低水平的特 定糖形的蛋白质。培养重组细胞系的条件也可影响糖基化模式。 在哺乳动物细胞中重组产生的抗体常常在该抗体的Fc和Fab区上发生糖基化。 许多糖基化的抗体包含糖类岩藻糖。岩藻糖在抗体中的存在可影响抗体对细胞上特定蛋 白的结合。例如，在抗体的Fc区中包含高水平的岩藻糖的抗体可具有减弱的与淋巴细胞 (例如天然杀伤细胞）上的受体的结合。不含岩藻糖的抗体与增强的ADCC(抗体依赖性 细胞细胞毒性）活性相关，尤其是在低剂量抗体的情况下。Shields等人，2002、J.Biol. Chem. 277:26733-26740 ;Shinkawa等人，2003、J.Biol.Chem. 278:3466。制备岩藻糖较少的 抗体的方法包括在大鼠骨髓瘤YB2/0细胞（ATCCCRL1662)中的生长。YB2/0细胞表达低 水平的FUT8mRNA，所述mRNA编码蛋白质的岩藻糖基化所必需的酶（a1，6_岩藻糖基转移 酶）。用于增加ADDC活性的备选方法包括抗体的Fc部分中的突变，特别是增加抗体针对 FcYR受体的亲和力的突变。已使用基于细胞的定向细胞毒性测定证实了增加的FcYR结 合与突变的Fc之间的相互关系。Shields等人，2001，J.Biol.Chem. 276:6591-6604;Presta 等人，2002,BiochemSoc.Trans. 30:487-490。 培养基或补料培养基中成分的浓度可影响蛋白质的糖基化模式。理想地，可通过 控制重组细胞系所生长的条件来增加或减少蛋白质的特定糖形。虽然已有很多研宄通过控 制培养基的成分来增加蛋白产率，但远少得多的报道涉及通过改良培养重组工程化细胞的 细胞培养基来调节蛋白质的糖基化。一个实例公开于美国专利No. 5, 705, 364中，该专利涉 及通过将链烷酸添加至培养基来控制由哺乳动物细胞产生的糖蛋白的唾液酸含量的方法。 然而，通过改良其中表达重组抗体的培养基来增加抗体的ADCC活性的可能性未得到充分 的解决。因此，开发用于培养哺乳动物细胞以表达具有降低的岩藻糖水平和增加的ADCC活 性的抗体的细胞培养基会是非常期望的。 3.公开内容概述 本公开内容涉及这样的发现：通过在包含高浓度（例如至少5mM)的甘氨酸的培养 基（在下文中被称作"高甘氨酸培养基"）中培养哺乳动物细胞，产生了具有有益性质的糖 蛋白（例如抗体）。具体地，在高甘氨酸培养基中培养哺乳动物宿主细胞增加非岩藻糖基化 糖形的水平。哺乳动物细胞可被用于产生显示增强的生物活性的抗体，所述增强的生物活 性包括增强的抗体依赖性细胞细胞毒性（"ADCC"）活性。 因此，本公开内容总的来说提供用于表达重组蛋白（例如抗体）的方法和组合物， 所述重组蛋白相较于在传统培养基中表达的糖蛋白而言具有改良的糖基化模式。所述方法 和组合物利用高甘氨酸培养基来在哺乳动物细胞中表达糖蛋白例如抗体，从而有利地导致 相较于在传统培养基中产生的糖蛋白而言具有降低的岩藻糖基化水平的糖蛋白。 此外，本公开内容的方法可用于在生产期间调节和控制蛋白质糖基化。在生产期 间产品糖基化的改善的控制是期望的，因为这将减小批次报废的风险和改善生产地点之间 的技术转移期间和工艺的按比例放大期间的控制。因此，所述方法可用于维持可再现的产 品糖基化模式而无需引入工艺变化。 能够经工程化以产生重组糖蛋白的哺乳动物细胞包括NS0细胞、CHO细胞、小鼠骨 髓瘤SP2/0细胞、幼仓鼠肾BHK-21细胞和人胚肾HEK0291细胞。在具体的实施方案中，NS0 细胞被重组工程化以产生抗体。 在一个方面，本公开内容提供了适合用于哺乳动物细胞培养的培养基，其包含介 于5mM和lOOmM之间的浓度的甘氨酸和任选地如本公开内容中指出的不同浓度的其它氨基 酸。所述培养基优选是化学成分确定的无蛋白质培养基。细胞培养基中甘氨酸的浓度可以 是例如 5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、llmM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、 20mM、22mM、25mM、30mM或50mM。在某些实施方案中，细胞培养基中甘氨酸的浓度以任何两 个前述实施方案为界，例如浓度的范围为5mM至10mM、7mM至10mM、10mM至15mM、12mM至 17mM、15mM至 20mM、16mM至 18mM、10mM至 30mM、10mM至 25mM、20mM至 30mM、10mM至 50mM、 20mM至50mM等。其它氨基酸可存在于培养基中，一般以通常发现于传统基本培养基中的 浓度存在。在一个实施方案中，氨基酸在本公开内容的培养基中的浓度见于表2中列出的 范围之中。培养基还可包含一种或多种另外的成分，例如维生素、微量元素、能量来源、脂肪 酸、生长因子、核苷、脂质、激素和/或抗生素。此外，培养基可包含缓冲液、重量摩尔渗透压 浓度调节剂和/或表面活性剂。这些另外的成分的进一步细节可见于5. 1节中。 在另一个方面，除甘氨酸以外的一种或多种氨基酸的浓度为表3或表4中显示的 浓度或低于这些浓度。例如，两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或十一种 氨基酸的浓度可以是表3或表4中列出的浓度或低于这些浓度。在一个实施方案中，赖氨 酸在培养基中的浓度介于0. 5mM和5.OmM之间。 在另一个方面，本公开内容提供了用于产生目标糖蛋白（"G0I"）例如目标抗体 ("A0I"）的方法，所述方法包括在细胞培养基中培养经工程化以分泌和表达所述G0I或A0I 的哺乳动物细胞例如NS0细胞，其中所述细胞培养基包含至少5mM，例如5mM、6mM、7mM、8mM、 9mM、10mM、llmM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、22mM、25mM或 30mM的 浓度的甘氨酸。所述AOI可以是例如鼠抗体、人源化抗体、嵌合抗体或完全人抗体。在具 体的实施方案中，细胞培养基中甘氨酸的浓度以任何两个前述实施方案为界，例如甘氨酸 浓度的范围为 5mM至 10mM、7mM至 10mM、10mM至 15mM、12mM至 17mM、15mM至 20mM、16mM至 18mM、10mM至30mM、10mM至25mM、20mM至30mM等。在某些实施方案中，所述培养基是化学 成分确定的无蛋白质培养基。 在一个实施方案中，A0I是HuLuc63 (依洛珠单抗）。依洛珠单抗的成熟￥11链（SEQ IDN0:1)、依洛珠单抗的成熟'链（SEQIDN0:2)、依洛珠本文档来自技高网...

【技术保护点】
产生目标抗体(“AOI”)的方法，包括：在适合表达和分泌所述AOI的条件下，于包含介于5mM和30mM之间的浓度的甘氨酸的细胞培养基中培养经工程化以分泌和表达所述AOI的NS0细胞，从而产生所述AOI。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·瓦尔玛，J·昆卡，Y·朱，
申请(专利权)人：艾伯维生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US