本发明专利技术公开了分离基质，其包含固定在支持物上的通过式R1-L1-N(R3)-L2-R定义的多种分离配位体，其中R1是五元或六元的取代或未取代的环结构或羟乙基或羟丙基基团；L1是亚甲基基团或共价键；R2是五元或六元的取代或未取代的环结构；L2是亚甲基基团或共价键；R3是甲基基团；和其中如果R1是羟乙基基团并且L1是共价键，R2就是取代的芳香环结构或取代或未取代的脂族环结构。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】多元阴离子交换基质 发曰月抟术领域 本专利技术涉及具有新配位体的分离基质，其可被用于纯化生物分子，例如蛋白。本专利技术基 质例如对于抗体的纯化是有用的。因此，本专利技术也包括层析基质用于分离的用途，用层析基 质从其它化合物中分离抗体的方法和合成分离配位体的方法。 专利技术背景 单克隆抗体（Mb)的临床成功是生物制药产业中最令人激动的成就之一，这导致在某 些情况下几吨（将批量生产的绝对规模的胰岛素和血浆蛋白相加）的年度生产需求。Mb 是市场上在生长因子后面的目前第二大类型的生物技术药物，但到目前为止是增长最快的 类型并被许多人相信是生物技术产业的未来。为满足此需求，生物培养容量使用高至25000 1的反应器而增加。此外，表达水平（目前在3-5g/l的范围内）被期望进一步增加，这将对 纯化工具例如高通量介质和过程解决方案的开发提出另外的要求。在大规模纯化（下游处 理）中的主要关注点与在实验室规模中典型的那些关注点不同；在大规模纯化中的重点是 开发稳健和成本有效的方案，和减少单元操作的数量以改善总体过程经济性。抗体制备中 当前的趋势表明使用A蛋白介质的亲和性层析是用于捕获抗体的最成本有效的备选方案。 在A蛋白捕获步骤后保留的常见污染物是抗体聚集体、渗漏的A蛋白、DNA和宿主 细胞蛋白。这些和任何偶生的病毒颗粒必须在进一步的纯化步骤，例如一个或多个层析步 骤中除去。阴离子交换、阳离子交换和疏水性相互作用层析步骤都被用于此目的，以流通模 式或以结合-洗脱模式。最近以来，多元离子交换基质显示给出对这些污染物的有效清除。 具体而言，描述于WO 2006/043896 (Al)中的多元阴离子交换基质对于除去聚集体、宿主细 胞蛋白和其它污染物是有用的，例如采用流通模式，其中污染物与基质结合和抗体在流通 物中回收并任选回收在洗涤缓冲液中。带有配位体N-甲基、N-苄基乙醇胺的这类基质作 为 Capto? adhere 和 Capto ImpRes adhere (GE Healthcare，瑞典）是商售可得的。 由于MAb的大制备体积和与基于Mab的疗法相关的高成本，在Mab纯化中存在增 加制备效率和通量的相当大的压力。也需要在用于治疗用途的Mab中降低免疫原性和另外 潜在有害的残余污染物的量。这意味着在具体步骤中在清除污染物方面的任何改善都是有 价值的，既因为它可降低制品中污染物的水平，也因为它也可使得具有较少步骤的纯化过 程有可能，这将导致较大的成本降低。 因此，需要对新的多元阴离子交换配位体，所述多元阴离子交换配位体具有对污 染物的改善的清除，所述污染物例如，抗体聚集体、宿主细胞蛋白、DNA、渗漏的A蛋白和来 自抗体和类似蛋白（例如抗体片段、抗体融合蛋白等）的DNA。 本专利技术概沐 本专利技术的一个方面在于提供新基质，其在将抗体从液体的其它组分中分离方面是有用 的。这用如权利要求1中限定的基质实现。 -个优点是，有效分离也可在高离子强度下实现。另外的优点是，抗体的收率和杂 质的清除被改善。 本专利技术的第二个方面是在生物分子的分离中使用新基质。这通过如权利要求中所 限定的方法实现。 本专利技术的第三个方面是从其它溶质中分离抗体。这用如权利要求中限定的方法实 现。 本专利技术的第四个方面在于提供合成分离配位体的方法，所述分离配位体适合于要 用于抗体分离中的基质的制备。这通过如权利要求中限定的方法实现。 本专利技术的另外合适的实施方案描述于从属权利要求中。 附图简述 图1.依据本专利技术的一个方面通过还原性胺化的叔胺配位体的合成。 图2.配位体合成的实例。 图3.将支持物（Su)与配位体偶合的实例，在此情况下通过溴化在支持物上的烯 丙基基团。 图4.以从用PreDictor ?板的初始筛选中选定的条件，本专利技术的原型基质的色谱 曲线。 图5.对起始样品、流通物和剥离物级分的SEC分析的重叠线图 (呈红色的峰代表起始样品，蓝色峰代表流通物，黑色峰代表剥离物级分）。起始样品 和流通物已经针对单体峰的高度进行归一化。 图6.带有N-甲基、N-苄基乙醇胺配位体的比较基质的色谱曲线。 图7.通过间隔基与配位体偶合的本专利技术的四种基质的结构。 术语"抗体"和"免疫球蛋白"在本说明书中可互换地使用。 术语"分离基质"在本文中用于表示由与一种或多种包含官能团的配位体偶合的 支持物组成的材料。术语"树脂"时常用于本领域中的分离基质。 术语"多元"分离基质是指能够提供至少两种不同的但协作的位点的基质，所述位 点与待结合的化合物相互作用。例如，这些位点之一可给出配位体和所关注的物质之间的 吸引类型的电荷-电荷相互作用。另一位点可给出电子受体-供体相互作用和/或疏水和 /或亲水相互作用。电子供体-受体相互作用包括诸如氢键键合、Π -JT、阳离子-JT、电荷 转移、偶极-偶极、诱导偶极等相互作用。"多元"分离基质也被称为"混合模式"分离基质。 术语"表面"在本文中意指所有外部表面，并在多孔支持物的情况下包括外侧表面 和孔表面。 术语"洗脱液"以在本领域中其常规含义使用，即，用以从分离基质中释放一种或 多种化合物的合适pH和/或离子强度的缓冲液。 术语"捕获步骤"在液体层析的语境下是指分离程序的初始步骤。最通常地，捕获 步骤包括澄清、浓缩、稳定和从可溶性杂质中显著纯化。在捕获步骤之后，可接着中间纯化， 其进一步降低杂质的剩余量，例如宿主细胞蛋白、DNA、病毒、内毒素、营养素、细胞培养基的 组分（例如消泡剂和抗生素）和产物相关的杂质（例如聚集体、错折叠的物类和聚集体）。 术语"一次性"在本文中在层析柱和其它分离基质的语境下意指意图用于单次使 用或有限次数使用的基质。一次性的产品有利地用于除去污染物（所述污染物甚至当处于 非常少的量时都是有害的），在此情况下将所述污染物吸附于基质并随后丢弃基质是方便 的。期望一次性产品的另一情况是用于无菌处理，这种情况下基质是无菌的或至少消毒的。 术语"精制步骤"在液体层析的语境下是指最终纯化步骤，其中将痕量杂质除去以 留下活性的、安全的产物。在精制步骤期间除去的杂质常常是靶分子的构象异构体或怀疑 的渗漏产物。 术语"Fc_结合蛋白"意指能够与抗体的可结晶部分（Fe)结合的蛋白并包括例如 A蛋白和G蛋白或保留所述结合性质的其任何片段或融合蛋白。 实施方案详沐 在本专利技术的一个方面中公开了分离基质，其包含多种分离配位体。该分离配位体通过 下式⑴定义。 R1-L1_ N (R3) _ L2_ R2 (I) R1此处是羟乙基或羟丙基基团或五元或六元的取代或未取代的环结构； L1是亚甲基基团或共价键； R2是五元或六元的取代或未取代的环结构； L2是亚甲基基团或共价键； R3是甲基基团； 如果R1是羟乙基基团并且L 1是共价键，那么R 2是取代的芳族环结构或取代或未取代 的脂族环结构。 如通过式（I)所示，配位体是带有亲核胺氮的叔胺，其适合与例如在支持物上的 亲电基团偶合。在此偶合之后，所述氮变为季铵基团，其允许在广泛的PH区间内与蛋白的 离子相互作用。Rp RJPR3基团提供适当水平的通过疏水性相互作用、氢键键合、π-电子 相互作用等与蛋白的另外的相互作用。此外，Rp RJPR3基团在氮周围的立体排列可调节 与蛋白的总相互作用强度和离子相互作用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离基质，其包含固定在支持物上的通过式(I)定义的多种分离配位体，R1 ‑ L1 – N (R3) – L2 –R2 (I)其中R1是五元或六元的取代或未取代的环结构或羟乙基或羟丙基基团；L1是亚甲基基团或共价键；R2是五元或六元的取代或未取代的环结构；L2是亚甲基基团或共价键；R3是甲基基团；并且其中如果R1是羟乙基基团并且L1是共价键，R2就是取代的芳族环结构或取代或未取代的脂族环结构。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：JL马洛伊塞，G罗德里戈，B诺伦，V库布哈，
申请(专利权)人：通用电气健康护理生物科学股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞典;SE
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