一种胰岛素样生长因子结合蛋白7真核表达质粒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种胰岛素样生长因子结合蛋白7真核表达质粒，其序列如SEQ ID NO.2所示，命名为pIRES2-ZsGreen1-IGFBP7真核表达载体。胰岛素样生长因子结合蛋白7真核表达质粒可用于制备抑制细胞增殖试剂。胰岛素样生长因子结合蛋白7真核表达质粒可用于制备抑制细胞侵袭试剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7) 真核表达质粒及其构建方法和应用。
技术介绍
胰岛素样生长因子结合蛋白7 (IGFBP7)是IGFBP家族成员，它是一种分泌蛋白，在 人体内多种组织、器官中都可检测到其表达。IGFBPs能调控胰岛素生长因子的生物利用度， 从而影响细胞生长、分化和增殖。IGFBP7可以影响多种人原癌基因的活化，从而抑制纤维母 细胞和黑色素细胞的增殖并促进细胞衰老。大量研宄已经表明IGFBP7在肝癌、乳腺癌、结 肠癌和甲状腺癌等多种肿瘤中表达异常，可能是一种新的潜在肿瘤抑制因子。此外，Min-A Seol等也发现IGFBP7在胆管癌细胞和组织中均表达下调。 尽管IGFBP7有望成为新的胆管癌治疗靶向因子，但其蛋白半衰期短，清除率高， 难溶于水，分子量大，易失活，易降解，稳定性差，非注射给药生物利用度低，纯化水平低，价 格高（lg可达十万元以上）等问题，极大地限制了其在临床上的应用。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供一种胰岛素样生长因子结合蛋白7真核表 达质粒及其构建方法，并为胰岛素样生长因子结合蛋白7用于肿瘤基础研宄和临床治疗提 供一种新型的基因药物。 为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为： 所述胰岛素样生长因子结合蛋白7真核表达质粒序列如SEQ ID N0. 2所示，命名 为pIRES-ZsGreenl-IGFBP7真核表达质粒。胰岛素样生长因子结合蛋白7真核表达质粒可 用于制备抑制细胞增殖试剂。胰岛素样生长因子结合蛋白7真核表达质粒可用于制备抑制 细胞侵袭试剂。 上述真核表达质粒的构建方法包括如下步骤： (1)提取HepGj^f壁细胞RNA作为模板，以SEQ ID N0. 3和SEQ ID N0. 4所示的序 列为引物，构建PMD19-T-IGFBP7质粒； (2)在pMD19-T-IGFBP7质粒中加入酶切位点，酶切位点为BglII-IGFBP7-EcoRI， 以加入了酶切位点的PMD19-T-IGFBP7质粒为模版，以SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示 的序列为引物扩增IGFBP7编码区，然后将该编码区克隆至pIRES2-ZsGreenl质粒，构建成 pIRES2-ZsGreenl-IGFBP7 真核表达质粒。 本专利技术通过将表达质粒转化入大肠杆菌，利用大肠杆菌自身机制进行质粒的大量 扩增，避开了直接从细胞中进行蛋白提取和纯化中遇到的蛋白量低，成本高，易降解等弊 端。含目的基因的转染菌的构建和质粒大提都保证了蛋白的持续表达，而且价格便宜。 本专利技术构建的胰岛素样生长因子结合蛋白7真核表达质粒（以下简称IGFBP7真 核表达质粒），分子量低，只有5. 4Kbp，而且易溶于水，通过将表达质粒转化入大肠杆菌，利 用大肠杆菌自身机制进行质粒的大量扩增，可长期保存，且菌种的保存确保了目的基因的 持续来源，价格低。通过进入细胞内表达，也提高了生物利用度。 总之，本申请通过构建IGFBP7真核表达质粒，并通过转染癌细胞，探索内源性 IGFBP7表达蛋白对恶性肿瘤细胞增殖、凋亡和侵袭等生物过程的影响，并为恶性肿瘤提供 一种新的基因治疗手段。RT-PCR调取基因的方法极大地扩充了 IGFBP7目的基因的来源， TA克隆的手段保证了目的基因片段的高度保守，表达质粒的构建及转染也保证了 IGFBP7 的持续稳定表达，从而避免了外源蛋白的不稳定性，从而为IGFBP7在恶性肿瘤中的治疗及 在肿瘤中作用机制的研宄提供了一种新的基因制剂。【附图说明】 图 1 为 RT-PCR 调取 IGFBP7cDNA 电泳图； 图2为pMD19-T-IGFBP7连接反应的PCR鉴定图；M:Marker ;1、2、3 :挑取的3个克 隆； 图3为pMD19-T-IGFBP7构建后测序结果与正常序列进行比对图；Sequence 0 : IGFBP7 正常序列；Sequence 1 :pMD19-T_IGFBP7 序列； 图4为pIRES2-ZsGreenl-IGFBP7载体构建时加入酶切位点时的PCR结果图； 图5为pIRES2-ZsGreenl-IGFBP7表达载体图谱及酶切鉴定； 图6为pIRES2-ZsGreenl-IGFBP7构建后测序结果与IGFBP7正常序列进行比对 图；Sequence 0 :IGFBP7 正常序列；Sequence 1 :pIRES2-ZsGreenl_IGFBP7 序列； 图7为质粒转染48h效果图；a?空白对照组b. pIRES2-ZsGreenl质粒转染组 c. pIRES2-ZsGreenl-IGFBP7 质粒转染组； 图8为实施例2中各组细胞周期分布图；A :KB组；B :NC组；C :IGFBP7组； 图9为实施例3中转染48h Transwell侵袭细胞染色图（X400) ;A :空白对照组； B :pIRES-ZsGreenl 转染组；C :pIRES-ZsGreenl-IGFBP7 组。【具体实施方式】 实施例1 pIRES-ZsGreenl_IGFBP7真核表达质粒的构建 1材料和方法 1. 1 材料 主要试剂：限制性内切酶（MBI、NEB)，T4DNA 连接酶（Takara)，pMD-19T-Simple 试 剂盒（Takara)，pIRES-ZsGreenl质粒（Yrbio)，质粒小量提取试剂盒（YRBIO)，DNA凝胶回 收试剂盒（YRBI0)，dNTP、Taq酶及buffer (NEB)，琼脂糖（西班牙），DNA Marker (全式金）， 酵母粉（Oxide)，胰蛋白胨（Oxide)。主要仪器：超净工作台（苏州集团安泰空气技术有限公司），微量移液器（德国 Eppendorf公司），电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），电子天平（德国 精密仪器厂），PCR仪（德国Eppendorf公司），水平电泳槽（北京六一仪器厂），凝胶成像 系统（美国KODAK公司），恒温水浴锅（海尔公司），微波炉（LG)，AqUapr〇超级纯水仪（艾 科浦），制冰机FM130 (GRANT)，立式圆形压力蒸汽灭菌锅（上海医用核子仪器厂），LP115型 pH 计（德国 Metter-Toledo GmbH 公司） 1. 2pMD19 - T - IGFBP7 质粒构建 1.2.1引物设计 Genbank数据库查询人IGFBP7mRNA序列，读取IGFBP7CDS区序列，设计引物为： Forward :5,-ATGGAGCGGCCGTCGCTGC-3,（SEQ ID N0. 3); Reverse :5,-TTATAGCTCGGCACCTTCACCTT-3,（SEQ ID NO. 4); Product ：Length = 849bp, GC%= 64. 1, Ta = 60. 5 1. 2. 2RNA 提取 TRIgol试剂提取RNA :l)IfepGj占壁细胞用0? 25%胰蛋白酶-EDTA消化后，PBS重 悬后收集至l〇ml离心管，5-10X 106/管，4000r/min，离心3min，重复清洗两次；2)加入lml Trigol，充分混匀，移入1. 5ml EP管中，室温静本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胰岛素样生长因子结合蛋白7真核表达质粒，其特征在于，所述胰岛素样生长因子结合蛋白7真核表达质粒序列如SEQ ID NO.2所示，命名为pIRES2‑ZsGreen1‑IGFBP7真核表达质粒。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：彭健，岳春燕，胥洪鹃，廖明媚，杨满意，
申请(专利权)人：中南大学湘雅医院，
类型：发明
国别省市：湖南;43