一种常染色体显性多囊肾病基因突变猪的生产方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种常染色体显性多囊肾病基因突变猪的生产方法及应用，利用基因编辑技术在猪PKD1基因5号外显子处引入插入突变，敲除猪PKD1基因，构建了一种常染色体显性多囊肾病基因突变猪模型。本发明专利技术建立的基因突变猪模型可用于常染色体显性多囊肾病的研究及药物筛选。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及一种常染色体显性多囊肾病基因突变 猪的生产方法及其应用。
技术介绍
常染色体显性多囊肾病（ADPKD)是一种常见的遗传性多囊肾病，在人群中的发病 率为1/400~1/1000。ADPKD以双侧肾脏出现充满液体的囊泡为主要特征，并伴随多种肾 外症状，随着疾病的发展，肾实质逐渐被囊泡和纤维化组织替代导致肾脏功能丧失。患者的 临床表现通常在20~30岁时出现，仅有不到2%的病例出现在胎儿或儿童时期。60岁时， 大约50%的患者将会出现终末期肾脏病（ESRD)，这占了所有ESRD病例的5%，这也是我国终 末期肾病中的排名第四的致病因素。ADPKD是一种系统性疾病，除了肾脏表现异常外还可以 影响全身其他器官，如：囊泡还可以发生在肝脏，胰腺，脾脏，甲状腺，蛛网膜和精囊腺，其中 精囊腺的囊泡可能是导致ADPKD患者不育的一个主要原因。颅内动脉瘤是导致ADPKD患者 死亡的另外一个原因，其发生率为5~7%，由于其往往发生在同一个家族成员中，因此认为 其发生是家族性遗传导致。高血压是ADPKD患者最为常见的症状，它与囊泡的发展及肾脏 体积的增大成正相关，大约60%的患者在肾衰竭前都会出现高血压。 目前人们已经发现ADPKD是由于PKD1和PKD2发生基因突变引起的，前者占据 了所有ADPKD病例的85%，后者则占据了 15%。研究发现PKD1突变能导致更严重的表型， 例如更高的几率发生高血压和血尿，而且与ADPKD2患者通常在74岁左右发生ESRD相比， ADPKD1的患者要早20年左右到终末肾衰竭。PKD1突变导致更严重表型的原因并不是由于 囊泡生长速度要快于PKD2突变，而是由于PKD1突变往往引起囊泡更早、更多地出现。 为了研究ADPKD的机理及筛选治疗药物，人们建立了大量小鼠模型。这些模型证 明了 PKD1与PKD2能调节细胞的增殖、凋亡、分化、极性及分泌过程，但是目前仍然没有对 ADPKD很好的治疗方法通过小鼠模型的研究出现。猪作为一种与人类在生理学及解剖学上 高度相似的生物，在生物医学研究中具有重要的价值。而且猪和人的肾脏在解剖功能上都 要比其他动物更为接近，都表现为多肾叶和多肾乳头结构，肾上腺位于肾的头部，右侧肾上 腺与后腔静脉壁相连，血流供应也是头部和尾部分开，而不是像多数物种那样纵向的血管 分布。猪已经在发育和儿童泌尿学研究中作为模式生物，主要研究膀胱尿液回流和肾内回 流。因此我们希望通过构建猪ADPKD疾病模型，给多囊肾病的治疗带来一些新的理论和方 法。 构建基因敲除动物模型需要使用的方法有常规基因敲除和基因编辑技术，前 者能够按照人们的目的定点改变基因序列。基因打靶技术最早是70年代在酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae)中实现的，它的实现需要达到以下几个要求：能够在实验室 中操作酵母DNA ;能够将外源DNA片段引入酵母细胞中；供体DNA能够与宿主基因组发生同 源重组；缺少与同源重组竞争的反应；能够利用筛选技术挑选出阳性产物。这些技术要求 在当时其他真核生物中都难以实现，直到后来小鼠ES细胞的建立才为真核生物基因打靶 筛选提供了良好的材料。同时在1988年，Mansour专利技术了正负筛选技术，大大提高了基因 打靶阳性细胞的富集，由此人们利用基因打靶技术在小鼠和酵母菌中获得了大量知识。虽 然基因打靶具有很多的优点，但是由于打靶效率低下（1(T 6)和缺少胚胎干细胞，使得在其 他物种中基因打靶技术的应用并不是十分广泛。随着分子生物学的发展，基因编辑技术的 出现大大提高了基因敲除效率。基因编辑技术目前主要包括：ZFN、Talen和CRISPR-Cas9， 他们通过特异地识别DNA序列，定点地引入DNA双链断裂，并利用宿主细胞中倾向错误的修 复机制一非同源重组的末端连接引入突变造成目的基因失活。因此本专利技术中，我们利用基 因编辑技术在猪成纤维细胞中高效实现PKD1基因突变，并通过体细胞核移植得到PKD1基 因突变的小型猪模型。这些基因突变猪模型的建立，为常染色体显性多囊肾病的研究及药 物筛选提供了很好的基础。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种常染色体显性多囊肾 病基因突变猪模型的生产方法，建立的基因突变猪模型可用于常染色体显性多囊肾病的研 究及药物筛选。 为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提出一种常染色体显性多囊肾病基因突变猪的 生产方法，包括下述步骤： 1)利用基因编辑技术在猪PKD1基因引入插入突变；2)采用PCR和测序鉴定方法 筛选猪PKD1基因插入突变的猪细胞克隆点；3)将筛选出阳性克隆点的细胞核用体细胞核 移植技术转入去核的卵母细胞中，在体外培养成重构胚，非手术法将其移入代孕母猪子宫 中，妊娠生产出克隆猪；4)采用PCR和测序方法鉴定出PKD1基因突变的克隆猪。 进一步的，所述插入突变为猪PKD1基因5号外显子第642-643位点处引入"T"的 插入突变，所述PKD1基因突变序列见SEQ ID No. 1。 所述插入突变还可以是猪PKD1基因5号外显子第642-643位点处引入"TGCT"的 插入突变，所述PKD1基因突变序列见SEQ ID No. 2。 更进一步的，所述引入插入突变的方法为ZFN、Talen和CRISPR-Cas9技术。 本专利技术还提供了一种鉴定PKD1基因敲除位点的PCR引物，所述PCR鉴定引物包 括： 引物 F : 5，-TAATTACAGGGGCCAAGCAG-3，； 引物 R : 5 ' -GAGGCAGGGAAGACGTTGT-3 '。 本专利技术还提供了前述生产方法构建的基因突变猪模型在针对常染色体显性多囊 肾病进行药物实验和临床前药物筛选中的应用。包括：分子、细胞、个体水平上对常染色体 显性多囊肾病的基础生物学研究，以期找到和发现影响囊泡形成的分子机理；利用小型猪 模型进行药物筛选，以得到治疗肾囊肿、肾功能衰退及其他多个器官并发症的药物。 本专利技术的有益效果在于： 本专利技术选择在肾脏解剖功能上与人更为接近的猪作为动物模型，构建常染色体显 性多囊肾病模型。通过基因编辑技术在猪PKD1基因引入插入突变，而构建了一种常染色体 显性多囊肾病模型，为研究疾病分子机理及为治疗药物筛选提供了合适的动物模型。【附图说明】 图1为PKD1基因编辑的靶位点； 图2为PCR鉴定克隆猪基因型； 图3为PKD1敲除小型猪照片； 图4为定量PCR检测克隆猪耳组织中PKD1的表达； 图5为定量PCR和Western blot检测三种基因型克隆猪肾脏中PKD1的表达； 图6为各年龄阶段各基因型小型猪肾脏的外观表现； 图7为各年龄阶段各基因型小型猪肾脏的组织学检测； 图8为利用免疫组化对肾囊泡来源、肾纤维化及上皮细胞增殖进行检测； 图9为克隆小型猪血尿素氮检测； 图10为克隆小型猪尿液24小时蛋白质含量检测； 图11为克隆小型猪影像学检测。【具体实施方式】 以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。 实施例1猪多囊肾病基因克隆及突变位点筛选 专利技术人以猪多囊肾病基因PKD1的mRNA序列（GenBank Accession No. :NM_001246202)为基础，通过ZFN、Ta本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种常染色体显性多囊肾病基因突变猪的生产方法，其特征在于，包括下述步骤：1）利用基因编辑技术在猪PKD1基因引入插入突变；2）采用PCR和测序鉴定方法筛选猪PKD1基因插入突变的猪细胞克隆点；3）将筛选出阳性克隆点的细胞核用体细胞核移植技术转入去核的卵母细胞中，在体外培养成重构胚，非手术法将其移入代孕母猪子宫中，妊娠生产出克隆猪；4）采用PCR和测序方法鉴定出PKD1基因突变的克隆猪。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李宁，贺津，胡晓湘，赵要风，李秋艳，于政权，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11