本发明专利技术公开了一种嵌合抗原受体双阴性T细胞的构建方法，根据CD3+/CD4－/CD8－双阴性T细胞的特性，体外分选出纯化的CD3+/CD4－/CD8－双阴性T细胞，利用多种细胞因子信号通路和TCR信号通路协同作用的原理，筛选出适合于双阴性T细胞激活和病毒转染的体外培养方案，能够快速、可控的激活双阴性T细胞，并将特定的嵌合抗原受体用慢病毒转染技术高效率表达于双阴性T细胞上，制备出CAR－DN－T细胞，使其能特异性的识别嵌合抗原受体对应的肿瘤细胞，促进CAR－DN－T细胞的进一步活化和增殖，并快速杀伤肿瘤细胞。本发明专利技术制备的CAR－DN－T细胞，可来源于同源异体的其他健康捐赠者，因此该细胞的制备摆脱了病人当下疾病状况的限制，可提前大规模制备，并随时根据临床诊断结果对病人进行低剂量、多次回输治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种嵌合抗原受体双阴性T细胞的构建方法，尤其涉及一种嵌合抗原受体⑶3+/⑶4_ /⑶8_双阴性T细胞的构建方法。
技术介绍
嵌合抗原受体T细胞(CAR - T细胞)技术，是利用基因工程和病毒转染技术给杀伤性T细胞构建一个外源性的嵌合抗原受体，使其可以特异性识别肿瘤标志物，并促进CAR - T细胞增殖、活化，持续性发挥肿瘤杀伤功能的技术。由于其对CD19+急性B淋巴细胞白血病的卓越的临床试验结果，已经引起医学界的广泛关注，被认为是最有希望治愈肿瘤的疗法。然而，当前的CAR - T临床试验都是从患者自体内分离出T细胞进行CAR — T细胞的制备，这就对患者的T细胞质量提出了很高的要求，临床应用上对患者的T细胞占PBMC的比例、T细胞增殖和激活能力，以及T细胞的杀伤功能等均有较高的适用性标准。临床试验实践中发现，超过80%的患者的T细胞达不到CAR — T细胞制备的要求，因此大多数患者无法从现行的CAR - T治疗中受益。鉴于这一问题，同源异体类CAR - T的制备成为研宄的热点。目前的一个研宄方向是通过基因敲除技术将同源异体来源的T细胞的T细胞受体(TCR)敲除(TCR - KO)后，使其失去MHC限制的特性，然后纯化出TCR敲除的T细胞，再进行CAR — T细胞的制备，使之发挥肿瘤杀伤作用而避免引起移植物抗宿主疾病(GVHD)。但在实际应用中遇到很大的技术瓶颈，主要原因是用于基因敲除技术的CRISPR - Cas9等载体分子量较大，导入T细胞困难、其基因敲除的效率低下。并且，如果使用病毒转染的方式导入CRISPR - Cas9等载体，又会出现嵌合抗原受体二次病毒转染的抵制现象，因此TCR —KO -CAR-T细胞得率极低，不能进行大规模制备，应用性差。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种嵌合抗原受体双阴性T细胞的构建方法，利用⑶3+/⑶4_ /⑶8_双阴性T(DN T)细胞的抗肿瘤特性和主要组织相容性抗原(MHC)的非限制性，结合已有的嵌合抗原受体技术，构建出一种新型的嵌合抗原受体双阴性T细胞(CAR — DN — T)。DN — T细胞可从正常人外周血中分离纯化，利用我们创建的独特激活和病毒转染方式，可高效地使其转染上特定的嵌合抗原受体，特异性杀伤嵌合抗原受体识别的肿瘤细胞。实验数据显示制备的CAR -DN-T细胞不具有MHC限制性，不会引起移植物抗宿主疾病(GVHD)，可以回输到其他适应症患者体内进行同源异体式的嵌合抗原受体T细胞(CAR - T细胞)临床治疗，是一种新型的CAR - T细胞，可以快速进行推广和产业化。为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术通过以下技术方案实现:一种嵌合抗原受体双阴性T细胞的构建方法，根据⑶3+/⑶4_ /⑶8_双阴性T细胞的特性，体外分选出纯化的CD3+/CD4- /CD8-双阴性T细胞，利用多种细胞因子信号通路和TCR信号通路协同作用的原理，筛选出适合于双阴性T细胞激活和病毒转染的体外培养方案，能够快速、可控的激活双阴性T细胞，并将特定的嵌合抗原受体用慢病毒转染技术高效率表达于双阴性T细胞上，制备出CAR -DN-T细胞，使其能特异性的识别嵌合抗原受体对应的肿瘤细胞，促进CAR -DN-T细胞的进一步活化和增殖，并快速杀伤肿瘤细胞。进一步的，所述体外分选方案为，利用CD4/CD8生物素标记抗体阴性分选和CD3/⑶28磁珠标记抗体阳性分选联合使用，分选出高纯度的⑶3+/⑶4_ /⑶8_双阴性T细胞，然后对纯化的双阴性T细胞加入特定配比混合的细胞因子混合液刺激，培养72小时后进行嵌合抗原受体病毒转染，得到高比例的CAR -DN T细胞。优选的，所述细胞因子混合液包括:IL — 2、IL — 15、GMCSF、TNFa、IFNy。本专利技术的有益效果是:1、本专利技术首次将⑶3+/⑶4_/⑶8_双阴性T(DN T)细胞作为母体细胞应用于CAR—T细胞的临床应用上，利用DN — T细胞的MHC的非限制性，开发出新型的CAR — DN — T细胞应用于同源异体临床治疗。制备的CAR -DN-T细胞，可来源于同源异体的其他健康捐赠者(包括病人家属等)，因此该细胞的制备摆脱了病人当下疾病状况的限制，可提前大规模制备，并随时根据临床诊断结果对病人进行低剂量、多次回输治疗，可在满足其疗效的同时，有效控制CAR - T细胞可能诱发的多种毒副作用，降低CAR - T细胞的临床使用风险。2、本专利技术创建的新型DN — T细胞的激活方案，多种细胞因子和T细胞受体联合刺激方案，能最大限度的提升嵌合抗原受体病毒的转染效率，提高CAR -DN-T细胞的制备效率。3、CAR -DN-T细胞可来源于健康人外周血的⑶3+/⑶4_ /⑶8_双阴性T(DN T)细胞，由于健康捐赠者免疫系统健全，此种同源异体的CAR -DN-T细胞的活化、增殖和杀伤功能均强于患者自体来源的CAR - T细胞，肿瘤杀伤能力更强。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本专利技术的【具体实施方式】由以下实施例及其附图详细给出。【附图说明】此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本申请的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中:图1为CD3+/CD4_ /CD8_双阴性T细胞示意图；图2为⑶3+/⑶4_ /⑶8_双阴性T细胞的分选、激活和嵌合抗原受体病毒转染流程图；图3为多种细胞因子和T细胞受体联合刺激方案有效提升双阴性T细胞病毒转染效率对比；图4为自体CAR —⑶8 — T细胞和同源异体CAR -DN-T细胞体外杀伤试验图 ，图5为自体CAR —⑶8 — T细胞和同源异体CAR -DN-T细胞体外杀伤试验图-* *图6为CAR — T 一 19和CAR — DN — T细胞治疗小鼠一人CD19+Raji B细胞淋巴瘤嵌合模型活体成像。图7为CAR — T 一 19和CAR — DN — T细胞治疗小鼠一人CD19+RajiB细胞淋巴瘤嵌合模型生存曲线。【具体实施方式】下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本专利技术。鉴于当前CAR - T细胞治疗的日趋成熟，其临床的有效性也逐渐凸显，因此，突破CAR — T细胞治疗的个体限制，使其能规模化和产业化是当下急需解决的当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种嵌合抗原受体双阴性T细胞的构建方法，其特征在于：根据CD3+/CD4－/CD8－双阴性T细胞的特性，体外分选出纯化的CD3+/CD4－/CD8－双阴性T细胞，利用多种细胞因子信号通路和TCR信号通路协同作用的原理，筛选出适合于双阴性T细胞激活和病毒转染的体外培养方案，能够快速、可控的激活双阴性T细胞，并将特定的嵌合抗原受体用慢病毒转染技术高效率表达于双阴性T细胞上，制备出CAR－DN－T细胞，使其能特异性的识别嵌合抗原受体对应的肿瘤细胞，促进CAR－DN－T细胞的进一步活化和增殖，并快速杀伤肿瘤细胞。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：范国煌，陈曦，李润生，
申请(专利权)人：范国煌，
类型：发明
国别省市：上海;31
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