本发明专利技术公开了一种绣线菊内生真菌发酵液中抑菌活性组份的提取与分离方法，它涉及天然活性物质的提取分离技术。该提取与分离技术的方法路线为：（1）绣线菊内生真菌的培养（2）除去发酵液中的菌丝体（3）萃取（4）浓缩（5）柱层析分离（6）过滤；本发明专利技术所述绣线菊内生真菌发酵液中抑菌活性组份的提取与分离方法，是一种步骤简单、准确性高、分离时间短、成本低、环保的提取与分离方法。本发明专利技术提取得到的抑菌活性组份对苹果腐烂病菌、茄褐纹病菌和梨黑星病菌的抑制效果明显，其中对苹果腐烂病菌的抑制中浓度（EC50）为2.2μg/mL，抑制效果最为明显，具有较好的抗植物病原菌活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物农药
，涉及天然活性物质的提取分离技术，具体涉及 绣线菊内生真菌的抗菌发酵液中抑菌活性组份的提取和分离方法。
技术介绍
在天然产物有效成分的提取方法中，常用的传统提取方法如浸渍法、蒸汽或水蒸 馏法、压榨法、渗流法和索氏提取等提取效率不高、有效成分损失多、周期长、工序多。传统 的纯化制备技术包括离心分离法、醇水法、盐析法、酸碱法、离子交换法和结晶法等，这些方 法存在步骤繁琐、效率较低等局限性。 植物内生真菌是一类生活在植物体内，并与植物营互利共生关系的真菌。内生真 菌在与宿主植物共生的过程当中，一方面接受来自宿主植物提供的光合产物、矿物质和水 等，一方面又会产生一些结构和功能新奇的代谢产物提高宿主植物的抗病虫害和抗干旱、 水涝等逆境的能力。 目前，关于植物内生真菌对植物病原菌的抑制作用的报道较少，从植物内生真菌 及其代谢物中快速提取分离具有抗植物病原菌的活性物质具有重要意义，对加速我国生物 农药的发展具有促进作用。
技术实现思路
关于绣线菊内生真菌发酵液中抑菌活性组份的提取和分离方法，本专利技术的目的在 于提供一种准确性高、分离时间短、成本低、环保的提取和分离方法。 绣线菊内生真菌发酵液中抑菌活性组份提取与分离的具体操作步骤如下： (1) 绣线菊内生真菌的培养 将绣线菊内生真菌接种到PDA固体培养基上，在28±1°C条件下活化培养3天，得到活 化菌；将活化菌接种到液体培养基上，接种量为每100mL液体培养基中接入直径6mm的活化 菌菌饼4~6个，在28± 1°C、转速160r ? mirT1条件下，摇床避光培养5~7天，得到发酵 液； (2) 除去发酵液中的菌丝体 将发酵液减压抽滤2~3次，分离出菌丝体，收集合并得到滤液；抽滤时控制压力 彡 0? 08MPa ; (3) 萃取 在滤液中加入等体积的正丁醇，常温萃取，得到第一正丁醇相和第一萃取液；在第一萃 取液中加入等体积的正丁醇，常温萃取，得到第二正丁醇相和第二萃取液；在第二萃取液中 加入等体积的正丁醇，常温萃取，得到第三正丁醇相和第三萃取液；合并第一正丁醇相、第 二正丁醇相和第三正丁醇相为正丁醇相； (4) 浓缩 将正丁醇相减压浓缩至浸膏状，得到浓缩浸膏，回收正丁醇； (5) 柱层析分离 采用石油醚湿法装柱、干法上样的方法，对浓缩浸膏进行柱层析分离；用乙酸乙酯和甲 醇梯度洗脱，收集得到抑菌活性组份的液体混合物； (6) 过滤 将抑菌活性组份的液体混合物浓缩干，得到白色固体，用乙酸乙酯洗涤，通过砂芯抽滤 漏斗减压抽滤，得到白色粉末；所述白色粉末即抑菌活性组份；所述抑菌活性组份中细交 链孢菌酮酸的含量为80%~85% ;细交链孢菌酮酸是一种真菌毒素，具有细胞毒活性和除草 活性；细交链孢菌酮酸的分子式为C1(lH 15N03，分子量为197 ;结构式为：【主权项】1. ，具体操作步骤如下： (1) 绣线菊内生真菌的培养 将绣线菊内生真菌接种到PDA固体培养基上，在28±rC条件下活化培养3天，得到活 化菌；将活化菌接种到液体培养基上，接种量为每lOOmL液体培养基中接入直径6mm的活化 菌菌饼4~6个，在28+rC、转速16化?mirTi条件下，摇床避光培养5~7天，得到发酵 液； (2) 除去发酵液中的菌丝体 将发酵液减压抽滤2~3次，分离出菌丝体，收集合并得到滤液；抽滤时控制压力 《0. 08M化； (3)萃取 在滤液中加入等体积的正了醇，常温萃取，得到第一正了醇相和第一萃取液；在第一萃 取液中加入等体积的正了醇，常温萃取，得到第二正了醇相和第二萃取液；在第二萃取液中 加入等体积的正了醇，常温萃取，得到第=正了醇相和第=萃取液；合并第一正了醇相、第 二正了醇相和第=正了醇相为正了醇相； (4)浓缩 将正了醇相减压浓缩至浸膏状，得到浓缩浸膏，回收正了醇； (5)柱层析分离 采用石油離湿法装柱、干法上样的方法，对浓缩浸膏进行柱层析分离；用己酸己醋和甲 醇梯度洗脱，收集得到抑菌活性组份的液体混合物； (6) 过滤 将抑菌活性组份的液体混合物浓缩干，得到白色固体，用己酸己醋洗漆，通过砂巧抽滤 漏斗减压抽滤，得到白色粉末；所述白色粉末即抑菌活性组份；所述抑菌活性组份中细交 链抱菌酬酸的含量为80%~85% ;细交链抱菌酬酸是一种真菌毒素，具有细胞毒活性和除草 活性；细交链抱菌酬酸的分子式为Ci"HigN〇3,分子量为197 ;结构式为：细交链抱菌酬酸具有抑制植物病原菌的活性。2. 根据权利要求1所述，其 特征在于；所述液体培养基由蛋白腺15g、葡萄糖20g、氯化巧0. 5g、磯酸氨二钟0.Ig、硫酸 亚铁0.Olg、硝酸钢Ig、水1L组成。3. 根据权利要求1所述，其 特征在于；步骤（4)浓缩时，向正了醇相中加入1/3体积的纯水形成共沸体系，浓缩条件；水 浴温度为 55~6〇°C，压力《0.OSMPa。4. 根据权利要求1所述，其 特征在于；步骤（5)中浓缩浸膏和上样的硅胶的质量比为1 ;2 ;上样的硅胶和装柱的硅胶的 质量比为1 ;20 ;所述硅胶的规格为200-300目； 所述梯度洗脱：先用己酸己醋洗脱，再用己酸己醋和甲醇梯度洗脱，通过薄层色谱和高 效液相色谱技术相结合分析确定洗脱梯度：按己酸己醋和甲醇的体积比为15~1 ;1~15 ; 最后到甲醇洗脱；收集得到抑菌活性组份的液体混合物，同时，回收己酸己醋和甲醇。5.根据权利要求1所述，其 特征在于；步骤（6)中减压抽滤的压力《0. 08MPa。【专利摘要】本专利技术公开了一种，它涉及天然活性物质的提取分离技术。该提取与分离技术的方法路线为：（1）绣线菊内生真菌的培养（2）除去发酵液中的菌丝体（3）萃取（4）浓缩（5）柱层析分离（6）过滤；本专利技术所述，是一种步骤简单、准确性高、分离时间短、成本低、环保的提取与分离方法。本专利技术提取得到的抑菌活性组份对苹果腐烂病菌、茄褐纹病菌和梨黑星病菌的抑制效果明显，其中对苹果腐烂病菌的抑制中浓度（EC50）为2.2μg/mL，抑制效果最为明显，具有较好的抗植物病原菌活性。CGMCC No.729220130308【IPC分类】A01P3-00, C12P17-10, C12R1-645, C07D207-38【公开号】CN104789613【申请号】CN201510159715【专利技术人】花日茂, 付稳, 吕培, 柏钰, 吴祥为, 史陶中 【申请人】安徽农业大学【公开日】2015年7月22日【申请日】2015年4月7日本文档来自技高网...
【技术保护点】
绣线菊内生真菌发酵液中抑菌活性组份的提取与分离方法，具体操作步骤如下：（1）绣线菊内生真菌的培养将绣线菊内生真菌接种到PDA固体培养基上，在28±1℃条件下活化培养3天，得到活化菌；将活化菌接种到液体培养基上，接种量为每100mL液体培养基中接入直径6mm的活化菌菌饼4～6个，在28±1℃、转速160r·min‑1条件下，摇床避光培养5～7天，得到发酵液；（2）除去发酵液中的菌丝体将发酵液减压抽滤2～3次，分离出菌丝体，收集合并得到滤液；抽滤时控制压力≤0.08MPa；（3）萃取在滤液中加入等体积的正丁醇，常温萃取，得到第一正丁醇相和第一萃取液；在第一萃取液中加入等体积的正丁醇，常温萃取，得到第二正丁醇相和第二萃取液；在第二萃取液中加入等体积的正丁醇，常温萃取，得到第三正丁醇相和第三萃取液；合并第一正丁醇相、第二正丁醇相和第三正丁醇相为正丁醇相； （4）浓缩将正丁醇相减压浓缩至浸膏状，得到浓缩浸膏，回收正丁醇；（5）柱层析分离采用石油醚湿法装柱、干法上样的方法，对浓缩浸膏进行柱层析分离；用乙酸乙酯和甲醇梯度洗脱，收集得到抑菌活性组份的液体混合物；（6）过滤将抑菌活性组份的液体混合物浓缩干，得到白色固体，用乙酸乙酯洗涤，通过砂芯抽滤漏斗减压抽滤，得到白色粉末；所述白色粉末即抑菌活性组份；所述抑菌活性组份中细交链孢菌酮酸的含量为80%～85%；细交链孢菌酮酸是一种真菌毒素，具有细胞毒活性和除草活性；细交链孢菌酮酸的分子式为C10H15NO3，分子量为197；结构式为：细交链孢菌酮酸具有抑制植物病原菌的活性。...
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：花日茂，付稳，吕培，柏钰，吴祥为，史陶中，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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