本发明专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒。通过采用本发明专利技术的试剂盒对原来体外反应工艺进行改进，大大缩短了反应时间，由原来的4小时缩短为1.5小时，节省了体外反应的原辅料，更加快捷、经济。本发明专利技术采用酶标抗体进行反应，比传统的酶标二抗工艺，检测更为准确灵敏。采用本发明专利技术方法包被的反应板吸附性强，能够有效促进检测的准确性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒。
技术介绍
口蹄疫是一种由口蹄疫病毒引发的高传染性的偶蹄动物疾病，由于其传播性强， 发病率高严重影响各国的畜牧业的发展，同时它亦是人畜共患病，社会危害性极大，已被列 为国家农业部归为一类传染病。根据血清型口蹄疫共分为A、0、C、Asia I、SAT I、SAT II、 SAT III七种，每个型又有若干个亚型，它们之间的抗原性都有很大的不同，给口蹄疫的防治 工作带来很多困难。开发一种实用、灵敏、特异的检测诊断方法十分必要。 目前关于口蹄疫的诊断技术大致分为五大类临床诊断、血清学诊断、生物学试验、 分子生物学检测技术以及环介导；其中以血清学中ELISA检测方法最为快速、敏感、准确。 关于口蹄疫酶联免疫吸附试验主要有液相阻断ELISA、固相竞争ELISA、间接ELISA和间接 夹心ELISA等，它们在应用中都存在一定的弊端。液相阻断法不仅可以检测病毒感染还可 以检测抗体评价疫苗免疫效果，在市场中得到广泛的推广，但其亦存在耗时，操作步骤繁 琐，人为误差大等弊端；间接法等虽然操作简单，较为快捷，但是不能定量评价样本中抗体 滴度。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒，能够快速、简 便、灵敏的进行检测。 本专利技术为解决上述问题所采取的技术方案是：一种A型口蹄疫竞争ELISA抗体检 测试剂盒，试剂盒内设有洗涤液、样品稀释液、显色液和终止液，还包括A型口蹄疫阴阳性 对照血清、包被A型口蹄疫多抗的96孔反应板、能够与反应板中包被的抗体和加入反应板 的样品中抗体反应生成结合物的A型口蹄疫病毒抗原，以及能够与所述结合物反应生成双 抗夹心结合物的辣根过氧化物酶标记的A型口蹄疫单克隆抗体。 所述A型口蹄疫多抗的96孔反应板是以A型口蹄疫兔抗血清为包被抗体，通过以 下方法制备得到： (1) 、A型口蹄疫兔抗血清与PB缓冲液按体积比为1 : 4000的比例稀释，然后以 100 μ L/孔的加样量加入到反应板中，备用； (2) 、将步骤（1)的反应板在温度为4°C下包被20h，经洗涤液洗涤2-3次后，向反应板 中加入封闭液，每孔200 μ L，备用； (3) 、将步骤（2)制得的反应板置于温度为4°C的条件下封闭16h，甩液后在温度为37°C 的条件下干燥3h，即制得A型口蹄疫多抗的反应板。 包被A型口蹄疫多抗的反应板所用封闭液为牛血清蛋白体积浓度为5%的PB缓冲 液。 所述A型口蹄疫兔抗血清的制备方法，包括以下步骤： 1) 、将A型口蹄疫重组蛋白与弗氏完全佐剂按I : 1的体积别混合乳化，制得乳化液， 备用； 2) 、对重为I. 8-2. 2kg的兔子进行首次免疫，每隔两周用乳化液对兔子进行一次加强 免疫； 3) 、末次加强免疫后的第7天进行一次耳缘静脉采血，检测血清抗体效价，0D450nm值 达到1.9-2. 1时，进行心脏采血，并将血清纯化即制得A型口蹄疫兔抗血清。 所述A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤： !D、对96孔反应板进行样品布局，划分为样品列、阳性对照列、阴性对照列和多个病毒 抗原对照孔，备用； 在反应板中样品列的各孔内分别加入50 μ L样品稀释液，然后向样品列第一行的 各孔分别加入50 μ L已稀释2倍的样品液，混合并搅拌均匀后制得稀释4倍后的样品液，再 从样品列第一行各孔中吸取50 μ L样品液加入到第二行的各孔中，制得稀释8倍后的样品 液，重复上述吸取、稀释过程，制得稀释不同倍数的样品液，采取同样的方法对阳性对照血 清、阴性对照血清和PBST进行稀释，得到稀释不同倍数的阳性对照血清液、阴性对照血清 液和病毒抗原对照液，备用； ③、向反应板中的各孔分别加入50 μ L的病毒抗原，之后进行封板，并在温度为37°C下 温育60min，备用； ：§、取出步骤@的反应板并用洗涤液连续清洗4-6次，然后在洗水纸上甩干，向反应板 的各孔内分别加入A型口蹄疫酶标单抗50 μ L，之后封板并在温度为37°C下温育35min，备 用； ⑤、取出步骤的反应板并用洗涤液连续清洗4-6次，然后向反应板的各孔内分别加 入底物溶液50 μ L，在温度为37°C下避光温育15min，然后向每孔内分别加入终止液50 μ L， 并在450nm的波长下读取吸光值，计算其抗体效价； ?、若抗体效价大于或等于1:64判为口蹄疫A型抗体阳性；1:64~1:32时，判为可疑； 小于或者等于1:32,判为阴性；可疑血清样品进行复测，复测抗体效价大于或等于1:64,判 为阳性，小于1:64判为阴性。 有益效果 一、通过采用本专利技术的试剂盒对原来体外反应工艺进行改进，大大缩短了反应时间，由 原来的4小时缩短为1. 5小时，节省了体外反应的原辅料，更加快捷、经济。 二、本专利技术采用酶标抗体进行反应，比传统的酶标二抗工艺，检测更为准确灵敏。 三、采用本专利技术方法包被的反应板吸附性强，能够有效促进检测的准确性。 具体实施例 一种A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒，试剂盒内设有洗涤液、样品稀释液、 显色液和终止液，还包括A型口蹄疫阴阳性对照血清、包被A型口蹄疫多抗的96孔反应板、 能够与反应板中包被的抗体和加入反应板的样品中抗体反应生成结合物的A型口蹄疫病 毒抗原，以及能够与所述结合物反应生成双抗夹心结合物的辣根过氧化物酶标记的A型口 蹄疫单克隆抗体。 所述A型口蹄疫多抗的96孔反应板是以A型口蹄疫兔抗血清为包被抗体，通过以 下方法制备得到： (1) 、A型口蹄疫兔抗血清与PB缓冲液按体积比为1 : 4000的比例稀释，然后以 100 μ L/孔的加样量加入到反应板中，备用； (2) 、将步骤（1)的反应板在温度为4°C下包被20h，经洗涤液洗涤2-3次后，向反应板 中加入封闭液，每孔200 μ L，备用； (3) 、将步骤（2)制得的反应板置于温度为4°C的条件下封闭16h，甩液后在温度为37°C 的条件下干燥3h，即制得A型口蹄疫多抗的反应板。 包被A型口蹄疫多抗的反应板所用封闭液为牛血清蛋白体积浓度为5%的PB缓冲 液。 所述A型口蹄疫兔抗血清的制备方法，包括以下步骤： 1) 、将A型口蹄疫重组蛋白与弗氏完全佐剂按I : 1的体积别混合乳化，制得乳化液， 备用； 2) 、对重为I. 8-2. 2kg的兔子进行首次免疫，每隔两周用乳化液对兔子进行一次加强 免疫； 3) 、末次加强免疫后的第7天进行一次耳缘静脉采血，检测血清抗体效价，0D450nm值 达到1当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种A型口蹄疫竞争ELISA抗体检测试剂盒，试剂盒内设有洗涤液、样品稀释液、显色液和终止液，其特征在于：还包括A型口蹄疫阴阳性对照血清、包被A型口蹄疫多抗的96孔反应板、能够与反应板中包被的抗体和加入反应板的样品中抗体反应生成结合物的A型口蹄疫病毒抗原，以及能够与所述结合物反应生成双抗夹心结合物的辣根过氧化物酶标记的A型口蹄疫单克隆抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王善普，刘玉宝，杜小波，张鹏翼，智雪玲，李权伟，李晓，杨少杰，董琴，
申请(专利权)人：洛阳莱普生信息科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41
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