本发明专利技术的技术方案是一种利用MGB探针结合荧光定量聚合酶链式反应法对肺癌患者外周血进行上皮细胞粘附分子表达检测，以反映体内循环肿瘤细胞水平,其方法是把需检测的目的标本,通过RNA提取、cDNA逆转录，后利用MGB探针进行荧光定量聚合酶链式扩增反应，后经荧光定量聚合酶链式扩增反应仪检测荧光强度，得到上皮粘附分子表达水平。本发明专利技术具有高灵敏度、高特异度的优点,同时又继承了一般聚合酶链式反应法高通量的优点,提高了检测效率,降低了检测成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及利用MGB探针结合巧光定量聚合酶链式反应法进行上皮细胞粘附分 子表达检测，W得到上皮粘附分子表达水平，W及该测试方法在检测肺癌患者体内循环肿 瘤细胞水平的应用。
技术介绍
目前对肺癌患者循环肿瘤细胞的检测多采用免疫磁珠分选法，该方法虽有较高 的准确性，但灵敏度不足，面对越来越少样本量的限制，该方法已不足W进行大量肿瘤患 者疾病筛选及多次术后疗效评估。 化CAM(上皮细胞粘附分子）于1979年由化rlyn等W在结肠癌中发现，被认为 是人类结肠癌组织的主要肿瘤相关抗原。化CAM不同程度地表达于所有的正常上皮和上皮 源性恶性肿瘤中，且多位于细胞间紧密连接处。在结缔组织及造血系统来源的细胞、脑组 织和血管内皮细胞中缺乏明显的化CAM的表达。因此，化CAM可作为用于检测非小细胞肺 癌CTCs的组织特异性表达标志物，并可W通过QRT-PCR等非常敏感的定量检测方法可对其 表达进行检测。 上皮特异性细胞粘附分子化CAM是最早W单克隆抗体技术鉴定出的肿瘤相关抗 原之一。它W多聚体的形式广泛表达于上皮组织表面，介导巧非依赖性细胞间同型黏附功 能，据此可归入粘附分子家族。 相关的研究提示化CAM还具备粘附分子家族的其他特性，参与包括细胞与基质的 相互作用、迁移、细胞分化、形态、细胞周期调节、信号传导、代谢等多种过程。同时，EpCAM在 多种上皮来源的肿瘤中呈过表达，提示其与肿瘤生长增殖等具有密切相关。多项研究已证 实化CAM的表达与乳腺癌和结肠癌细胞的增殖、周期分布、转移有关。 化CAM在上皮来源的组织中广泛表达（单层上皮，假复层上皮，移行上皮），定位于 细胞基底外侧膜。一般鱗状上皮不表达，部分上皮来源的腺上皮细胞如肝细胞，上皮角化细 胞、胃壁细胞、肌上皮细胞和胸腺皮层上皮亦不表达。间叶组织、肌肉和神经内分泌组织也 不表达化CAM。此外，淋己样来源的细胞化CAM也呈阴性表达。不同的组织类型化CAM的表 达水平存在差异。如在胃肠道，胃上皮呈阴性或极弱表达，小肠粘膜相对高表达，结肠在已 知化CAM阳性的细胞中表达水平最高。 大部分粘附分子在细胞发生恶性转化期间和其后都发生表达的改变，或上调，或 下调或原位表达，化CAM也不例外。在大部分上皮来源的肿瘤中化CAM都呈高表达。在间 质或外胚层来源的肿瘤如神经原性肿瘤，肉瘤，黑色素瘤或淋己瘤等，EpCAM不表达。[000引经研究证实，实体瘤患者的外周血中存在肿瘤细胞，CTCs的存在是肿瘤转移必需 的，因此研究者可把CTCs作为未来正式的一种预后标志物。另外，它也是实体瘤的先锋， 被认为是一种有效的抗肿瘤药物的新祀标。 化CAM(上皮细胞粘附分子，非小细胞肺癌CTCs,外周血循环肿瘤细胞水平。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用MGB探针结合巧光定量聚合酶链式反应法对肺癌患者外周 血进行上皮细胞粘附分子表达检测，W反映体内循环肿瘤细胞水平。 为了实现本专利技术的目的，提出W下技术方案： 一种巧光定量聚合酶链式反应检测外周血循环肿瘤细胞水平的方法，该方法利用 MGB探针结合巧光定量聚合酶链式反应进行上皮细胞粘附分子表达检测，得到上皮粘附分 子表达水平，用W检测肺癌患者体内循环肿瘤细胞，其特征在于，所述上皮细胞粘附分子表 达检测流程包括W下步骤： 1)在非小细胞肺癌患者肘正中静脉处采取外周血液2mU将血液保存于邸TA抗凝 血管中，并放置在4 °C冰箱内存储； 。W300G离屯、10分钟，弃去上层血浆，保留血细胞层； 3)利用红细胞裂解液去除血细胞中的红细胞，保留其中有核细胞，在-80°C冰箱 中保存； 4)将经上述处理的样本加入Trizol液提取总RNA; 5)将总RNA经过逆转录反应得到相应的cDNA样本；6)制备化CAM,利用化t-PCR绝对定量法进行化CAM表达水平检测，并W健康志愿 者标本为阴性对照。 在步骤4中，提取总RNA的过程如下： 4. 1)匀浆化作用，取出约50~lOOmg步骤3中处理后的样本，放入10ml的无酶 玻璃匀装管中，加入1ml的Trizol液，在电动匀浆器充分匀浆； 4. 2)分离阶段，把匀浆液转移至5ml的无酶离屯、管，室温放置5min，然后加入 0. 2ml的氯仿，盖紧离屯、管，用手剧烈摇荡离屯、管15s;[002引 4. 3)再次离屯、，室温放置5min，放入4 °C预冷后的离屯、机，12000巧m，4 °C离屯、 30min； 4. 4)RNA的沉淀，取上层水相转移至一新的无酶离屯、管，加入等量异丙醇，室温放 置lOmin,再次放入4°C预冷后的离屯、机，12000巧111，4°C，离屯、lOmin; 4. 5)RNA的洗脱，倒掉上清，留取底部沉淀，加入1ml现配的预冷好的75%的无 酶己醇，所述配比为DEPC水：无水酒精=1:3,振荡洗漆RNA沉淀一次，然后放入4°C预冷 的离屯、机，7500巧m, 4°C,离屯、5min; 4.6)RNA的再溶解，倒掉上清，取沉淀置于超净工作台，室温下自然风干5min，此 时RNA沉淀变透明，再在管中加入20ulDEPC水，50°C水浴lOmin，充分溶解，将所提取的 总RNA保存于-80°C冰箱备用； 在步骤5中，cDNA的合成包括步骤；5. 1)在冰上准备0. 5ml无酶PCR反应管并建立逆转录反应体系1化1，其中，总RNA 3ul；01igodT18primerlul；DEPCtreatedwaterSul；[002引将W上混合物W6000巧m，4rC，离屯、5sec，旋转混匀，按W下反应条件进行第一 步逆转录反应；65°C，5min，再W4°C存lOmin; 5. 2)继续在冰上依次加入 5Xreactionbuffer4ul，RibolockRNAseInhibitor lul，RevertAidM-ReverseTranscriptaselul，dNTPmixture2ul，总反应体系 20ul; 将W上共20ul的混合离屯、5sec，液旋转混勾，按w下反应条件进行第二步逆转 录反应：42°C，60min，70°C，5min;再W4°C存lOmin，合成的cDNA存放在-2°C的冰箱储存备 用。 5. 3)使用逆转录试剂盒中提供的1.化bRNA进行逆转录反应，监测反应体系；[003引 5. 4)质量检测：采用试剂盒里提供的485bp的管家基因GAPDH引物对获得的cDNA 进行PCR扩增。 在步骤5. 4)中，cDNA进行PCR扩增包括步骤； 5. 4. 1)在冰上建立W下反应体系 25ul，包括普通PCRreactionmix1:ure12. 5ul， GAPDH的上、下游引物各lul，cDNA模板lul，加无菌去离子水至25ul; 5. 4. 2)反应条件；预变性94°C3min，变性94°C45s，退火55°C30s，延伸 72°C:45s，共30个循环，终延伸5min;5. 4. 3)将PCR产物通过1. 5 %琼脂糖凝胶进行电泳，120V恒压电泳30min。 在步骤6中，EpCAM制备包括步骤：[003引 6. 1)将获得的PCR产物进行1%低烙点琼脂糖进行恒压电泳，DNA上样量50ul，电 泳30min，将电泳产物在紫外投射仪下透视，从琼脂糖凝胶中切下所需本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种荧光定量聚合酶链式反应检测外周血循环肿瘤细胞水平的方法， 该方法利用MGB探针结合荧光定量聚合酶链式反应进行上皮细胞粘附分子表达检测，得到上皮粘附分子表达水平，用以检测肺癌患者体内循环肿瘤细胞，其特征在于，所述上皮细胞粘附分子表达检测流程包括以下步骤：1）在非小细胞肺癌患者肘正中静脉处采取外周血液2mL，将血液保存于EDTA抗凝血管中，并放置在4℃冰箱内存储；2）以300G离心10分钟，弃去上层血浆，保留血细胞层；3）利用红细胞裂解液去除血细胞中的红细胞，保留其中有核细胞，在‑80℃冰箱中保存；4）将经上述处理的样本加入Trizol液提取总RNA；5）将总RNA经过逆转录反应得到相应的cDNA样本；6）制备EpCAM，利用Qrt‑PCR绝对定量法进行EpCAM表达水平检测，并以健康志愿者标本为阴性对照。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘志东，李云松，苏崇玉，
申请(专利权)人：刘志东，李云松，苏崇玉，
类型：发明
国别省市：北京;11
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