本发明专利技术公开了一种垃圾堆肥中草坪耐盐强化复合微生物菌群的制备方法及应用。本发明专利技术的方法就是：采用逐步提高NaCl的浓度来强化城市生活垃圾堆肥中的微生物，最终筛选得到制备出的强化耐盐微生物菌剂。本发明专利技术旨在获得强化堆肥微生物，并为强化城市生活垃圾堆肥微生物菌剂的草坪应用提供技术支撑。本发明专利技术更进一步公开了强化复合微生物菌群在提高盐胁迫草坪草高羊茅保护酶活性方面的应用。本发明专利技术旨在获得强化堆肥微生物，并为强化城市生活垃圾堆肥微生物菌剂的草坪低温应用提供技术支撑。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于环境保护
，设及生活垃圾堆肥中草坪耐盐强化复合微生物菌 群的制备方法。
技术介绍
微生物菌剂尤其是由多种微生物组成的复合微生物菌剂是近年来发展起来具有 广泛应用前景的生物技术。微生物菌剂不仅可W修复石油污染的上壤和降解水体中的有机 污染物，还可W防治病虫害，促进作物生产和增产增收，有些微生物菌剂可W提高植物的抗 逆性自20世纪70年代W来，欧美日本等国家或地区都相继研制成功了一些复合菌剂，很多 已经开始进行大规模的生产，并形成了系列化的产品。其中20世纪80年代由日本琉球大 学教授研制的EM(有效微生物群）获得了极大的成功，已经广泛应用在90多个国家设及植 业养殖业及环境净化方面，并取得了显著的经济效益和社会效益。基于微生物菌剂在一些 发达国家研究和推广得较早，相关技术较为成熟，应用也更普遍。近年来，国外也没有再出 现像EM那样可W在全世界都引起很大效应的微生物菌剂。 相对于国外发达国家相关微生物菌剂的研究，我国是从20世纪80年代才开始微 生物菌剂的相关研究，从理论到实践，从单一菌种的利用到多个菌种的复合应用，也相继取 得了一些成果。南京农业大学生物防治产品主要有防治黄瓜根结线虫病害的蜡质芽抱杆 菌AT31菌剂(使命/线灭，LS20120060)、防治蔬菜±传病害的微生态制剂(蔬得康)、宁盾系 列产品，已获生物肥料正式登记。山东生物所木霉菌剂(防治灰霉病)、湖南植保所光合细菌 (促进光合作用）、镇江润州短吻杆菌（防治鱗翅目害虫）W及宁夏诺得曼生物技术公司根瘤 菌(促进豆科植物生长)等。最近几年，国内有很多关于复合菌剂研制的报道，主要利用微生 物净化环境，降解有机污染、提高粮食产量和提高植物抗性等方面。有研究表明利用从水产 养殖的优良水质中分离得到的优势菌种研制出水质净化剂，将其用于淡水鱼养殖池中，对 降低水体中的C0D，NHs-N，亚硝酸盐等起到了理想的效果。还有研究表明，微生物菌肥均能 在适宜的浓度下不同程度的促进生菜的生长，改善生菜品质，降低硝酸盐含量。但该些大都 还处于试验研究与初步应用水平，还没有广泛应用于实际。生防菌本身具有固氮、解磯、解 钟的作用，刺激植物产生适量生长素；降解大分子有机物，提高有机肥利用率；微生物菌剂 就像是植物的开胃剂；保护细胞膜的完整性、维持较高水平的根系活力和叶绿素含量，该方 面就不光是一个促生的作用，也有一种抗逆的作用。微生物菌剂诱导植物体内多种抗逆基 因的表达，显著提高植物体的抗氧化酶活性。同时微生物菌剂可W防止作物收获后产生病 害，诱导抗逆基因表达，诱导SOD等多种相关物质的产生。所W，微生物菌剂对于改善植物 在逆境即盐胁迫、干旱胁迫和低温胁迫条件下的建植有积极的影响。 草坪草除了具有美化环境、净化空气、防止水±流失、保持生态平衡、给人们提供 休息和运动场所等功能外，尚有调节小气候的作用。然而草坪草同其它植物一样，常遭 受不良环境的影响，如干旱、高温、低温、盐溃等逆境都会抑制草坪草的生长，使草坪质量下 降。尤其是盐碱、低温(冷害）和干旱是强烈限制草坪生长的3大非生物因素。 盐溃化±壤在世界各地都有广泛的分布，全世界盐溃化±地面积约为 955X106hm2,约占陆地总面积的10%。目前，我国有20X106hm2W上盐碱地和7X106hm2W 上盐溃化±壤，约占耕地面积的20%。而盐碱逆境胁迫是限制草坪草生长的一个主要环境 因素之一。±壤盐溃化对植物的危害主要表现在抑制植物生长，破坏光合作用功能、造成细 胞膜伤害、保护酶活性降低等。长期W来，盐碱±的改良主要采用的是灌概排水、施加化学 改良剂或一些矿质肥料和种植耐盐碱的植物。近年来，微生物菌剂在改良盐碱地的应用也 成为了研究的热点。施用微生物菌剂后盐碱±的细菌总数有所增加，±壤的容重降低明显。 即改善了±壤微生物区系，提高生物活性。有研究表明对表±层和5cm±层滨海盐碱±壤 施用活性微生物菌剂，结果表±层硫酸盐含量显著降低，而氯化盐含量下降需要较高菌剂 浓度。5cm±层硫酸盐升高明显，氯化盐变化较小，最终±壤酸碱度降至中性。该就说明微 生物菌剂可W降低±壤盐碱度，提高养分利用率。总体来看，微生物菌剂在盐溃化±壤中表 现出较好的效果，该充分显示了微生物菌剂在盐碱地改良上的应用潜力。 城市生活垃圾堆肥是自然界中的微生物，比如说是细菌和真菌等，通过它们的生 理代谢，可W加快对有机物的分解速度，进而将其变成腐植酸的过程。城市生活垃圾堆肥有 氧处理过程中，会产生大量的热量，垃圾中的有机物被分解完成，同时也杀死了垃圾中的病 菌等，而产芽抱的杆菌能够大量存在。各种微生物对有机物分解能力和分解速度是不尽相 同的，随着温度、季节的变化，堆肥过程中的微生物群落和数量亦不相同；且已有研究表明， 堆肥中的微生物群落是相当复杂的。堆肥中微生物数量及种群分布与堆肥有机物质成分和 含量、微生物间的相互作用等多种因素密切相关。有人研究接种外源菌剂对堆肥中微生物 数量和酶活性变化的影响，为微生物菌剂的应用和堆肥工艺的改进提供了依据。猪粪枯杆 堆肥复合微生物菌剂能够更有效地促进和优化堆肥过程迅速提高堆体温度提高最高温度 延长高温期时间并能更有效地提高堆体养分水平。牛粪堆肥试验表明，添加本源菌剂能快 速提高堆肥温度，促进堆体发酵腐熟，缩短堆制时间；从纤维素和半纤维素降解率看，添加 菌剂处理后明显比未添加菌剂的对照处理强，由此可见，添加微生物菌剂有利于牛粪堆肥 腐熟。而针对从固体废气物基质中提取微生物菌种，并将其用于实验和生产中，还有人分别 从鸡粪发酵和牛粪中筛选出高效降解菌并配制成相应的复合微生物菌剂，为复合微生物菌 剂的应用奠定了一定的基础，该对前期堆肥微生物菌剂的配置都提供了依据。近期的相关 文献及生产表明：微生物菌剂作为成为一种新型的生物技术已经应用到我们的社会生活和 生产当中。尤其是微生物菌剂在促进植物生长、提高植物抗性等方面的研究不胜枚举。但是 关于微生物菌剂的来源与制备，大多数研究者也仅仅只限于从±壤或污泥中提取和筛选。 有关堆肥中微生物菌落结构、堆肥菌种之间共生及相互影响关系具有模糊性和复杂性。强 化制备垃圾堆肥中微生物菌种，将强化堆肥微生物菌种作为接种剂，配制成不同浓度的强 化复合微生物菌剂接种应用，将具有重要的意义。 从生活垃圾堆肥下简称堆肥）中筛选出有效菌株，再配制成相应微生物菌剂， 具有广泛的应用前景。一些研究表明城市生活垃圾堆肥过程中发现，在有机物被分解的过 程中，生物群落也发生了重要的变化，主要是致病菌大量减少，而产芽抱的杆菌则数量剧 增。生活垃圾在经过高温发酵处理后得到的堆肥酸性变大而且含盐量变高，因此处于高渗 体系环境中的微生物具有一定的耐酸、耐盐和耐高温特性。不论是一般的微生物菌剂，还是 堆肥微生物菌剂中菌种的选育，都是直接从自然环境(或堆肥）中筛选出有效的菌株，再配 制成微生物菌剂应用于相应的领域。而将自然环境(或堆肥)中的微生物经过某些特定方向 的强化，进而得到一些高效强化微生物菌剂的研究尚无报道。
技术实现思路
本专利技术的方法就是采用逐步提高化C1的浓度来强化城市生活垃圾堆肥中的微生 物，最终筛选得到制备出的强化耐盐微生物菌剂。本专利技术旨在获得强化堆肥微生物，并为强 化城市本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种垃圾堆肥中草坪耐盐强化复合微生物菌群的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）材料：生活垃圾堆肥取自天津市小淀垃圾堆肥厂，垃圾堆肥的pH为7.62，有机质含量12.12 %，全氮量5.18 %，有效磷含量77.92 mg·kg‑1，全钾50.83 g·kg‑1，容重0.85 g·L‑1，饱和含水量66.58 g·mL‑1；（2）培养基：1）富集培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.4‑7.6，加15g琼脂成固体培养基；2）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.0‑7.2，加15g琼脂成固体培养基；3）高氏Ⅰ号培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 20g，K2HPO3 0.5g，MgSO4 0.5g，FeSO4 0.01g，水1000ml， pH 7.2‑7.4，加琼脂20g成固体培养基，配置时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，导入煮沸的水中，在火中加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补水至1000ml；4）马丁氏培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KHPO3 1g，MgSO(7H2O) 0.5g，1%孟加拉红水溶液，3.3ml，水1000ml，pH自然，加琼脂15g成固体培养基，临用前加入0.03%链霉素稀释液100ml，使每ml培养基含链霉素30µg；（3）菌种的富集：将垃圾堆肥样品称取10g置于无菌锥形瓶中，加入100mL无菌水振荡均匀后，取10mL悬浮液于盛有100mL富集培养基的锥形瓶中，在28℃，220r/min下振荡培养3d ，即为复合微生物菌群；（4）耐盐复合微生物菌群的强化混合微生物菌群耐盐强化采用的是逐步增加盐浓度的方法进行，NaCl的浓度分别为（w/w）0.5%、1%、1.5%、2% 、2.5%和3%，在驯化过程中，视OD600增长而逐步提高盐浓度，NaCl的浓度以5g/L的梯度增加到30g/L，每增加一次NaCl的浓度，待菌体增长量稳定后，继续增加NaCl的浓度，逐级驯化出耐盐混合微生物菌群；(5)强化复合微生物的分离及纯化：1）倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏Ⅰ号琼脂培养基、马丁氏（PDA）琼脂培养基高温灭菌，冷却至55~60℃时，在马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液，终质量浓度为30µg/ml，混均匀后分别倒平板；2）制备混合微生物稀释液：用移液枪吸取1ml强化后的混合微生物菌悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为10‑1稀释液，以此类推制成10‑2、10‑3、10‑4、10‑5和10‑6µg/ml几种浓度的稀释液；3）涂布：用移液枪分别吸取0.2ml不同浓度的稀释菌悬液准确放入相应培养基平板中央，每个不同浓度梯度处理重复3次，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀；4）培养：牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培养箱中培养，将含高氏Ⅰ号培养基和马丁氏培养基（PDA）的平板倒置于28℃培养箱中培养；（6）平板划线分离法挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许菌苔在新的上述3种培养基上进行划线纯化，直到培养基上长出来的是纯培养，如不纯，仍需重复该步骤，最后对强化的复合微生物进行鉴定；经过多次划线纯化得到强化复合微生物菌群。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：多立安，赵树兰，高星星，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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