本发明专利技术提供一种检测Leber病线粒体T14502C试剂盒，由DNA提取混合液、扩增T14502C片段的PCR混合液、针对T14502C设计的一对外引物和一对内引物、限制性内切酶、阳性对照和阴性对照组成。不仅解决了传统上从Leber病患者血液中提取DNA的问题，减轻被检者的痛苦；而且还解决了跨地区传递样本的问题，血滤纸片、毛发以及口腔粘膜刮片或唾液斑滤纸片等可以很容易的放在信封内，并可通过邮寄的方式跨地区传递。本发明专利技术试剂盒应用成本低；检测流程简便、快速，结果判读直观，应用本发明专利技术可确保检测结果的特异性和稳定性，可在检测与Leber病相关的线粒体基因ND1T14502C突变中的应用。
【技术实现步骤摘要】
一种检测Leber病线粒体T14502C试剂盒
本专利技术属生物
，涉及用于检测与Leber病相关的线粒体DNAT14502C突变的试剂盒，还涉及一种与Leber病相关的线粒体基因突变的检测方法，特别涉及检测线粒体ND6T14502C突变的方法，以及上述方法或上述的试剂盒在检测与Leber病相关的线粒体DNAT14502C突变中的应用。
技术介绍
Leber遗传性视神经病变（Leber'sHereditaryOpticNeuropathy，LHON，简称Leber氏病）是一种母系遗传性视神经病变，主要累及视网膜、巩膜筛板前部视乳头黄斑束纤维，导致视神经退行性变的母系遗传病，严重的影响着人们正常的生产、生活。根据国家卫生部（http://www.moh.gov.cn/）最新数据统计我国现有的低视力人口约有710万，盲人约有500万，占总人数的0.4%，成为世界上视力损伤最严重的国家之一。其中，由视神经病变引起的约为55万。1871年德国眼科医生TheodorLeber首次报道该病的临床症状、体征和遗传特性。1972年Erickson等发现LHON的遗传方式呈典型的母系遗传特征。1988年WallaceDC等发现了第一个与LHON相关的线粒体基因组DNA（mitochondriaDNA,mtDNA）突变位点ND4G11778A。目前已报道50多种线粒体DNA突变位点与LHON致病相关(http://www.mitomap.org/)，其中90%以上的LHON的家系是由氧化磷酸化复合物I亚基上的ND4G11778A、ND1G3460A和ND6T14484C这3个原发突变位点所致。为了进一步探究LHON的发病机制，在全国范围内收集了大量的LHON家系，除上述3个原发性突变位点外，相继发现了tRNAMetA4435G、ND4G11696A、tRNAThrA15951G、ND1T3866C、ND1T3394C、ND5T12338C和ND6T14502C突变与LHON相关，与线粒体相关的Leber氏病在早期临床症状不明显，早期的检查常常会因此被耽误，尤其在我国偏远农村地区，这种情况普遍存在。因此，在高危人群和易感人群中开展mtDNA突变筛查，对于预防和控制与线粒体相关的原发性Leber氏病的发生有着极其重要的作用。自发现与mtDNA突变相关的疾病以来，检测线粒体突变位点的检测方法主要还是序列测定。直接测序法是鉴定突变的黄金标准，但该操作繁琐，费用昂贵限制了它的广泛应用。近年来，国内相继报道了Leber遗传性视神经病变的基因诊断试剂盒及其检测方法，以满足对线粒体突变突变进行广泛筛查的需要，如福建医科大学于2005年申请了的基因诊断试剂盒及其检测方法专利（专利号：200510006097.8），该专利技术是根据90％以上的Leber氏遗传性视神经病变患者的线粒体DNA突变属于3个原发性致病位点突变（G11778A、G3460A和T14484C），设计和合成位点特异性PCR引物，直接以全血样作PCR的DNA模板，利用等位基因特异性多重PCR技术，单管一次性PCR反应，同时检测LHON患者的线粒体DNA的3个原发性致病突变位点，具有简便快速、高效、费用低、特异性好、只需微量血液样本等优点，为LHON患者的快速临床基因诊断提供一种简易、可靠的方法和试剂盒，具有巨大的普及推广应用价值。但是该方法存在血液中直接PCR扩增的难度加大，实验中采取的多重PCR的条件要求将会增加，检测方法跟普通的方法没有本质的区别。2006年杭州优思达生物科技有限公司建立一种以单核苷酸多态性核酸试纸快速检测LHON线粒体DNA中G11778A位点突变的新方法（专利号：200610003429.1）。在应用单核苷酸多态性核酸检测试纸条进行多态位点或突变位点的检测时,需要设计一条特异性延伸引物，这条引物的3’端碱基紧临多态性碱基或突变碱基,其在DNA聚合酶的作用下开始延伸,带有抗原标记与模板对应的双脱氧单核苷酸(ddNTP)被连接到延伸引物上。虽然该方法能够实现短时间内的检测阳性位点，但PCR扩增条件严格，存在假阴性的几率大大增加。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前检测ND6T14502C突变的方法所存在的缺点，提供一种快速、简便、准确、经济的检测Leber病相关的线粒体DNAT14502C突变的试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，由DNA提取混合液、扩增T14502C片段的PCR混合液、针对T14502C设计的一对外引物、针对T14502C设计的一对内引物、限制性内切酶、阳性对照、阴性对照组成。其中，提取DNA提取混合液主要由细胞裂解液、蛋白酶K、氯仿、苯酚、无水酒精组成；扩增T14502C片段的PCR混合液试剂包括dNTP(脱氧单核苷酸)、10×PCR缓冲液、MgCl2、三蒸水和Taq酶(DNA聚合酶)，针对T14502C设计的外引物包括外前向引物F:GCATAATTAAACTTTACTTC(SEQIDNO:1)，外反向引物R:AGAATATTGAGGCGCCATTG(SEQIDNO:2)；针对T14502C设计的内引物包括内前向引物F:TACTCCTCAATAGCCATCGCTGTAGTATATCCAAAGACAACCATCATTCCCCCTAAATTAA(SEQIDNO:3)，内反向引物R:TCTGTTGAGTGTGGGTTTAGTAA(SEQIDNO:4)；限制性内切酶包括限制性内切酶PacⅠ；阳性标本对照是含有线粒体序列第14502位点发生酶切样本；阴性标本对照是线粒体序列第14502位点不能够发生酶切样本。在上述试剂盒中，在扩增T14502C的PCR混合液中添加用于提高延伸反应特异性的少许二甲基亚砜（0.1-0.2μl为宜）本专利技术的另一个目的是提供所述试剂盒在检测与Leber病相关的线粒体基因ND1T14502C突变中的应用。通过以下步骤实现：（1）基因组DNA的提取：运用蛋白酶K消化裂解法，从少量的血液标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液的样本中提取基因组DNA；（2）特异性PCR扩增：使用Primer5.0软件和Oligo7.0软件根据SEQIDNO:5所示的人类线粒体基因序列所设计的引物F外/R外、F内/R内是能扩增出包含上述Leber病的线粒体突变位点的片段，F外/R外扩增出为线粒体DNA的核苷酸14081-15017，其序列为序列表中的SEQIDNO:1、2；F内/R内扩增出为线粒体DNA的核苷酸14441-14656，其序列为序列表中的SEQIDNO:3、4（3）酶切鉴定：将上述PCR产物用限制性内切酶PacⅠ对T14502C突变位点处进行酶切；（4）突变检测：聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，直接根据酶切PCR产物产生的DNA片段数量及DNA片段大小，检测mtDNA是否发生T14502C突变。在上述检测mtDNAT14502C突变的方法中，可从血标本（如一滴血）、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液的样本中快速提取基因组DNA，根据取样方式或被测样本形式不同，对不同样本进行相应的预处理，处理方法如下：（1）血标本（如一滴血）：取20～200μl少量血标本（如一滴血）或1cm2的血滤纸片放入1.5mlEP管（离心管），加入900μl红细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测Leber病线粒体T14502C试剂盒，其特征在于，由DNA提取混合液、扩增T14502C片段的PCR混合液、针对T14502C设计的一对外引物、针对T14502C设计的一对内引物、限制性内切酶、阳性对照和阴性对照组成，其中，提取DNA提取混合液主要由细胞裂解液、蛋白酶K、氯仿、苯酚、无水酒精组成；扩增T14502C片段的PCR混合液试剂包括dNTP、10×PCR缓冲液、MgCl2、三蒸水和Taq酶，针对T14502C设计的一对外引物是外前向引物F: GCA TAA TTA AAC TTT ACT TC (SEQ ID NO:1)，外反向引物R: AGA ATA TTG AGG CGC CAT TG (SEQ ID NO:2)；针对T14502C设计的一对内引物包括内前向引物F:TACTCCTC AATAGCCATCGCTGTAGTATATCCAAAGACAACCATCATTCCCCCTAAATTAA(SEQ ID NO:3)，内反向引物R:TCTGTTGAGTGTGGGTTTAGTAA(SEQ ID NO:4)；限制性内切酶是限制性内切酶PacⅠ；阳性对照是含有线粒体序列第14502位点不能够发生酶切样本；阴性对照是线粒体序列第14502位点发生酶切样本。...
【技术特征摘要】
1.一种检测Leber病线粒体T14502C试剂盒，由DNA提取混合液、扩增T14502C片段的PCR混合液、针对T14502C设计的一对外引物、针对T14502C设计的一对内引物、限制性内切酶、阳性对照和阴性对照组成，其中，提取DNA提取混合液主要由细胞裂解液、蛋白酶K、氯仿、苯酚、无水酒精组成；扩增T14502C片段的PCR混合液试剂包括dNTP、10×PCR缓冲液、MgCl2、三蒸水和Taq酶，其特征在于，针对T14502C设计的一对外引物是外前向引物F:GCATAATTAAACTTTACTTC(SEQIDNO:1)，外反向引物R:AGAATATTGAGGCGCCATTG(SEQI...
【专利技术属性】
技术研发人员：管敏鑫，蒋萍萍，冀延春，梁敏，张娟娟，金筱芬，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。