本发明专利技术公开了一种针对中枢神经系统的DNA疫苗的制备方法，及其对中枢神经系统疾病如帕金森综合症的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术一方面涉及髓鞘相关蛋白在帕金森综合症中的病理作用及作为药物靶点 的价值研究；另一方面涉及髓鞘相关蛋白在制备针对中枢神经系统的生物工程DNA疫苗中 的应用，并包含编码所述髓鞘相关蛋白的DNA片段的疫苗和疫苗制备方法。
技术介绍
帕金森综合症（Parkinsonism，PD)是发生于中年以上成人黑质和黑质纹状体通 路变性疾病。目前公认其病因是神经细胞的退行性变，主要病变部位在黑质和纹状体。其 中有一种被称为黑质细胞的神经细胞，黑质细胞数量的逐渐减少、功能的逐步丧失，致使多 巴胺减少，从而引起ro的发生。目前，只有通过预防、外科治疗及康复治疗等手段对ro进 行治疗，但是效果不尽如人意。因此，利用一些有神经保护、促进变性神经再生以及促进神 经可塑性重建的治疗手段有可能是目前治疗ro更有效的措施。 髓鞘及其相关蛋白在神经再生中起着重要的作用。受损伤后，中枢神经系统 (Central Nervous System, CNS)神经轴索无法再生导致永久性的损伤。这种对神经纤维 再生的抑制很大程度上是由于髓鞘相关蛋白阻碍轴索再生引起的。髓鞘相关蛋白-A型勿 动蛋白（Nogo-A)、髓鞘磷脂相关糖蛋白（Myelin-associated glycoprotein, MAG)和少突 胶质细胞髓鞘糖蛋白（Oligodendrocyte-myelin glycoprotein,OMgp)，位于有髓纤维的节 旁区，是抑制神经再生的髓鞘的主要组成蛋白。它们通过共同的受体NgR，通过统一信号通 路对神经再生起着抑制作用。Tenasin-C(TNC) ,Tenasin-R(TNR)，位于有髓纤维的朗飞氏节 上，它们在调节神经再生及神经可塑性中发挥着重要的作用。 近年来发现，髓鞘有可能直接参与帕金森综合症的病理发生发展。在帕金森综合 症早期的病人脑内，甚至还没有出现明显临床症状的时候，已经能够检测到髓鞘的异常变 化了。而且，髓鞘出现异常的区域恰恰是帕金森综合症病人最容易受影响的脑区。另外，研 究发现，髓鞘在经验依赖性的神经突触可塑性调节中发挥着重要作用。这说明髓鞘及其相 关蛋白有可能亦是治疗帕金森综合症或其他中枢神经系统退行性病变的药物靶点。 DNA疫苗是一种新型疫苗。它利用载体表达编码目的蛋白的DNA序列。DNA疫苗 具有安全性好、稳定性高、易设计、易大规模生产、并能诱导T细胞和B细胞介导的细胞和体 液免疫等优势。Nogo_A、MAG、0Mgp、TNC和TNR抑制神经再生。阻断以上分子不仅可以促进 神经再生，并对神经元有保护作用。目前，在试图消除分子的抑制性作用方面已经取得了不 同程度的成功。已有文献报道利用编码MAG、TN-R和Nogo-A重组DNA疫苗治疗脊髓损伤的 模型大鼠，发现该疫苗对脊髓损伤后大鼠的行为及神经再生都有很强的改善作用。疫苗接 种后8周将脊髓背侧半横断损伤，与对照组相比，接种疫苗组产生了健康的皮质脊髓束轴 索的再生（CST)。接种该DNA疫苗对神经再生的促进作用，在创伤性脑损伤的动物模型上也 得到了验证。部分机制研究发现，编码髓鞘相关蛋白的这种DNA疫苗可以调控棘突神经生 长因子的表达，并通过其神经保护作用实现。我们研究结果显示N 〇g〇-A、MAG、OMgp、TNC和 TNR可能对ro病理起重要作用。 中枢神经系统退行性病变如中风、帕金森综合症在病理机制及治疗机理上存在着 很多相似之处。本专利技术发现，Nogo-A、MAG、OMgp、TNC和TNR可能是治疗的靶点。基于 此，本专利技术构建了编码N 〇g〇-A、MAG、0Mgp相关抗原片段的基因疫苗，并在APP / PSl双转基 因模型小鼠上对该疫苗的安全性和有效性进行了综合的评价。结果显示，该疫苗在APP / PSl双转基因模型小鼠模型上，延缓了 ro的病理进展。
技术实现思路
本专利技术提供的数据明确地阐述了髓鞘相关蛋白Nogo-A、MAG、Omgp、TNC和TNR在 帕金森综合症中的病理机制。并在研究基础上，开发出编码Nogo-A、MAG和OMgp相关抗原 表位片段的新型DNA疫苗。这种疫苗在模型小鼠APP / PSl上可以预防和治疗ro的病 理发展。 本专利技术的目的在于提供髓鞘相关蛋白Nogo-A、MAG、Omgp、TNC和TNR在ro病理机 制的实验数据；编码髓鞘源性蛋白的DNA疫苗及其制备方法和用途。 本专利技术的一方面在于发现髓鞘相关蛋白Nogo-A、MAG、Omgp、TNC和TNR参与ro的 病理发展，并发现它们是治疗ro的新的药物靶点。 本专利技术的一方面在于提供一 DNA疫苗，所述疫苗主要由编码大鼠MAG的l-5Ig区 域、编码小鼠OMgp胞外8个脂质体受体样蛋白（8LRP)、编码人bNogo-A的N端、编码人 Nogo-A胞外端的66个氨基酸的DNA片段构成。 本专利技术的又一方面还在于提供制备这些疫苗的方法，所述方法包括如下步骤： 1.构建重组质粒，将所述疫苗各自的基因片段顺序连接并亚克隆到载体质粒。 2.由限制性内切酶进行双酶切。 3.丙氨酸连接子位于两个相邻结构域之间便于多肽折叠。 4.通过PCR和测序检查合成产物，确认所得产物为所需DNA疫苗。 5.利用电转染的方法，对疫苗进行免疫。 进一步地，本专利技术的载体质粒为pcDNA3. 1，所述限制性内切酶为BamH I和Xba I。 本专利技术的再一方面在于提供所述DNA疫苗在预防中枢神经系统病变中的应用，所 述中枢神经系统包括但不限于以下疾病：帕金森综合症、多发性硬化、脊髓损伤、创伤性脑 损伤、中风以及脑肿瘤等。【具体实施方式】 实验方法 一、免疫共沉淀 I :准备脑组织裂解物 取一只成年大鼠脑，放入组织匀浆器，加入6mL裂解液（IOmM Tris-盐酸，pH=9， 150mM氯化钠溶液，0. 5% Triton x-100,1%脱氧胆酸钠，0. 5%十二烷基硫酸钠（SDS)，2mM 乙二胺四乙酸（EDTA)和蛋白酶抑制剂）后在冰上均匀研磨；然后将组织匀浆转到I. 5mL EP 管中，4°C下缓慢晃动20分钟（EP管置于冰上的水平摇床上）；然后再在4°C下以16000rcf 离心15分钟；收集上清至新1.5mL EP管中。收集的样品用BCA蛋白含量测定试剂盒检测 蛋白浓度为6mg / mL。 II :清洗 用IOmL平衡盐溶液PBS稀释20mg脑蛋白；将稀释后的脑蛋白加入150 ii L蛋白A 琼脂糖珠后在4°C孵育1小时； III :免疫沉淀 准备如下溶液：1，琼脂糖珠：向各试管加蛋白A/G plus (santa cruz : sc-2003) 50 ii L ;2,脑蛋白：0. 5mL体积中含脑蛋白Img ;3,同时按如下比例准备待加入的抗 体：a)抗-APP(A8717from Sigma) :1 u L ;b)抗_MAG(chemicon，MAB1567) :1 u L ;c)抗-Nogo A(Abeam:ab62024) :2iiL。d)模拟对照：只含脑蛋白和琼脂糖珠。 随后将相应量的脑蛋白和琼脂糖珠在4°C下震荡孵育过夜。 IV :清洗 用1?1?4裂解液（1501111恥(31溶液，1%咿-40,0.5%00(：(脱氧胆酸），0.1%505和 50mM Tris，p本文档来自技高网...
【技术保护点】
DNA疫苗，所述疫苗包含编码大鼠MAG的1‑5Ig区域的DNA片段、编码小鼠OMgp胞外8个脂质体受体样蛋白的DNA片段、编码人Nogo‑A N端的DNA片段和编码人Nogo‑A胞外端的66个氨基酸的DNA片段。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：毛力真，
申请(专利权)人：毛力真，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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