乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂的制备方法，该方法利用氨基酸处理连接了配基的吸附微球，使其上的配基结合更牢固，降低了乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂脱落的几率和速率，提高了乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂在应用时的安全性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体指一种乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂的制备方 法。
技术介绍
乙型肝炎病毒（HBV)属嗜肝DNA病毒科（h印adnaviridae)，基因组长约3. 2kb，为 部分双链环状DNA。由于中国乙肝病毒的状况严重，所以国家已经制定了疫苗注射制度。但 研宄已表明，很多乙肝病毒具有"免疫逃逸"的性能，即具备感染疫苗接种者的能力，导致疫 苗的应用前景不容乐观。 研宄发现，血液中的毒蛋白是乙型肝炎的主要致病因子，乙肝毒蛋白介导乙肝病 毒对于肝细胞的感染。现有技术中公开了一种乙型肝炎抗原蛋白的吸附材料及其制备方 法，该方法采用与乙型肝炎病毒表面蛋白（HBsAg)亲和的多肽（配基）与微球相连，通过多 肽结合乙型肝炎病毒表面蛋白膜蛋白（HBsAg)，从而达到清除血液中乙肝毒蛋白，降低病毒 对于肝细胞感染的效果。 目前制备该类型吸附剂所常用的微球是琼脂糖微球、聚乙烯醇微球、壳聚糖微球 等，与微球相连的配基有多肽，蛋白等。在制作微球时，有的微球会需要先用酸、碱预处理， 然后采用试剂活化微球表面，有的直接则是直接活化；然后再加入交联剂或者偶联剂连接 微球和配基，交联剂（偶联剂）上的功能基团如羟基和配基上的氨基发生反应，使配基结合 在微球上。但是这些吸附剂在使用中，随着时间推移，会有不同程度的配基脱落发生，而且 容易受到温度、水流等环境影响，可能是由于配基与交联剂之间的结合发生了逆向反应而 脱落，当配基脱落后血液中，可能引起免疫反应，具有一定的安全风险。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中制备的乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂上配基 容易脱落的缺陷，提供一种操作简单、能大幅度提高配基结合牢固度的乙型肝炎病毒表面 蛋白吸附剂的制备方法。 为实现上述目的，本专利技术所设计的，包 括以下步骤： 1)准备与乙型肝炎病毒表面蛋白亲和的配基，及作为载体的微球； 2)活化微球表面基团； 3)利用交联剂使所述配基结合在微球上，得到吸附微球； 4)在溶液环境下，向吸附微球中添加氨基酸，氨基酸添加重量与配基的重量比大 于2. 5:1000,待氨基酸结合到吸附微球上后，洗去多余的氨基酸，得到乙型肝炎病毒表面 蛋白吸附剂。 优选地，所述氨基酸选自赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮 氨酸、缬氨酸、组氨酸、甘氨酸中一种或几种的混合。小分子性质稳定的氨基酸均可以采用， 实验结果显示混合的氨基酸效果优于单一的氨基酸，特别是大小不均等的氨基酸组合对配 基的固定效果较好。 优选地，所述氨基酸为组氨酸：甘氨酸：赖氨酸=1:2. 1:0. 5的混合物，所述配基 为钠离子牛磺胆酸共转运多肽，所述微球为琼脂糖微球。 优选地，所述步骤4)中，向吸附微球中添加氨基酸后，使氨基酸结合到吸附微球 上的条件为，于25~40°C的环境中，静置含有吸附微球与氨基酸的溶液30分钟以上。适宜 的温度可以促进氨基酸结合到微球上去。 优选地，所述步骤4)中，洗去多余的氨基酸所采用的洗涤液为PBS。 本专利技术原理：微球经过处理活化后其上基团暴露通过交联剂与配基相连，但是该 连接受多种因素影响，加入的氨基酸起到了封闭裸露基团的作用，对未参加反应的微球及 交联剂上裸露的基团进行共价结合的过程，可能也影响了配基上的功能基团与交联剂的结 合部位，加固了配基与交联剂之间的结合，使配基不容易从微球上脱落。理论上，氨基酸封 闭对多种配基都有效。 本专利技术的有益效果：通过采用氨基酸处理已连接了配基的吸附微球，使其上的配 基结合更牢固，降低了乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂脱落的几率和速率，提高了乙型肝炎 病毒表面蛋白吸附剂在应用时的安全性。【具体实施方式】 下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明，以下实施例是对本专利技术的解 释而本专利技术并不局限于以下实施例。 实施例1 ，包括以下步骤： 1)制备与乙型肝炎病毒表面蛋白亲和的钠离子牛磺胆酸共转运多肽（NTCP)及载 体的琼脂糖微球； NTCP及琼脂糖微球如何制备为已公开的现有技术，本申请中不做赘述。 2)活化琼脂糖微球表面基团：在2L的反应器中加入琼脂糖微球溶液600ml，2mol/ L的NaOH水溶液400ml，混匀，加入乙二醇双缩水甘油醚400ml后，置于恒温摇床中，在37°C 反应1小时。结束反应，将琼脂糖微球过滤，用大量蒸馏水冲洗至pH = 7,将活化好的凝胶 状琼脂糖微球储存在4°C备用。 3)将NTCP通过化学交联的方法连接到上琼脂糖微球上： 将琼脂糖微球凝胶200ml加入至0. 3mol/L的硼酸缓冲液600ml中，pH值控制在 8. 0~10. 0范围内，加入3g NTCP，在37°C反应12小时，停止，回收未反应的NTCP，得到结 合了配基的吸附微球溶液。 4)向吸附微球溶液中添加赖氨酸，赖氨酸添加重量与配基的重量比为1 :200,静 置2h，再用蒸馏水冲洗，洗去多余的氨基酸，得到乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂1，保存在 0· 2mol/L pH = 7. 4的磷酸缓冲液中。 实施例2 ，包括以下步骤： 1)制备与乙型肝炎病毒表面蛋白亲和的钠离子牛磺胆酸共转运多肽（NTCP)及载 体的琼脂糖微球； NTCP及琼脂糖微球如何制备为已公开的现有技术，本申请中不做赘述。 2)活化琼脂糖微球表面基团：在2L的反应器中加入琼脂糖微球溶液600ml，2mol/ L的NaOH水溶液400ml，混匀，加入乙二醇双缩水甘油醚400ml后，置于恒温摇床中，在37°C 反应1小时。结束反应，将琼脂糖微球过滤，用大量蒸馏水冲洗至pH = 7,将活化好的凝胶 状琼脂糖微球储存在4°C备用。 3)将NTCP通过化学交联的方法连接到上琼脂糖微球上： 将琼脂糖微球凝胶200ml加入至0. 3mol/L的硼酸缓冲液600ml中，pH值控制在 8. 0~10. 0范围内，加入3g NTCP，在37°C反应12小时，停止，回收未反应的NTCP，得到结 合了配基的吸附微球溶液。 4)向吸附微球溶液中添加苯丙氨酸和异亮氨酸的混合物，混合物为苯丙氨酸：异 亮氨酸=1:1，氨基酸添加重量与配基的重量比为3 :1000,于恒温30°C水浴箱上静置1小 时，再用PBS(0.0 lM pH 8.0)洗3次，洗去多余的氨基酸，得到乙型肝炎病毒表面蛋白吸附 剂2,保存在0· 2mol/L pH = 7. 4的磷酸缓冲液中。 实施例3 ，包括以下步骤： 1)制备与乙型肝炎病毒表面蛋白亲和的钠离子牛磺胆酸共转运多肽（NTCP)及载 体的琼脂糖微球； NTCP及琼脂糖微球如何制备为已公开的现有技术，本申请中不做赘述。 2)活化琼脂糖微球表面基团：在2L的反应器中加入琼脂糖微球溶液600ml，2mol/ L的NaOH水溶液400ml，混匀，加入乙二醇双缩水甘油醚400ml后，置于恒温摇床中，在37°C 反应1小时。结束反应，将琼脂糖微球过滤，用大量蒸馏水冲洗至pH = 7,将活化好的凝胶 状琼脂糖微球储存在4°C备用。 3)将NTCP通过化学交联的方法连接到上琼脂糖微球上： 将琼脂糖微球凝胶200ml加入至0. 3mol/L的硼酸缓冲液600ml中，pH值控制在 8. 0~10. 0范围内，加入3g NTCP，在37°C反应12小时，停止，回收未本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂的制备方法，包括以下步骤：1)准备与乙型肝炎病毒表面蛋白亲和的配基，及作为载体的微球；2)活化微球表面基团；3)利用交联剂使所述配基结合在微球上，得到吸附微球；4)在溶液环境下，向吸附微球中添加氨基酸，氨基酸添加重量与配基的重量比大于2.5：1000，待氨基酸结合到吸附微球上后，洗去多余的氨基酸，得到乙型肝炎病毒表面蛋白吸附剂。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王业富，韩振伟，李卫，
申请(专利权)人：武汉瑞法医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42