一种蟾蜍二烯内酯类化合物选择性分离纯化方法技术

本发明专利技术提供了一种蟾蜍二烯内酯类化合物选择性分离纯化方法。基于低pH值条件下，氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物的离子性质的不同，我们采用带正电荷的XCharge C18柱发展了一种新型的高选择性的高效液相色谱分离方法。流动相无缓冲盐添加，便于样品制备后处理。选取蟾蜍皮95%乙醇提取物反相色谱制备分离所得的一个馏分，通过反相色谱制备获得两类共八个化合物。该方法可以实现氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类、非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类的高效制备，特别是对氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类，该方法解决了拖尾问题，并表现出的较好的峰形和优异分离效果。从而提供了一种高效系统分离蟾蜍二烯内酯类化合物的新方法，为该类化合物的抗癌活性研究和单一成分的新药开发提供物质基础和技术支撑。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及赡餘二帰内醋类化合物的分离纯化，具体地说是一种反相色谱采用带 正电荷的X化argeC18柱在低抑条件下高选择性地分离纯化赡餘二帰内醋类化合物的新 方法。该方法对氨基酸修饰的赡餘二帰内醋类化合物和非氨基酸修饰的赡餘二帰内醋类化 合物表现出较优的分离效果。
技术介绍
赡餘二帰内醋（bufadienolides)是一类C24留，并且在留体母核的C17位接有 目六元不饱和内醋环，该类化合物也常被称为赡餘二帰内醋。Liselotte.Krenn,Pieter S.Steyn和高慧敏等分别对赡餘二帰内醋合物具有的生物活性进行了综述。该些活 性主要包括局麻、强也、升压、Na7K+-ATP酶抑制活性及抗肿瘤等作用（L.Krenn，B. Kopp,Bufadienolidesfromanimalandplantsources,Phytochemistry, 48(1998) 1-29. ；P.S.Steyn,FanieR.vanHeerden,Bufadienolidesofplantandanimalorigin,Nat. Prod.Rep, 15 (1998) 397-413. ；H.Gao,R.Popescu,B.Kopp,Z.Wang,Bufadienolidesand theirantitumoractivity,P'Jat.Prod.Rep.,28(2011)953-969.)。另外，此类赡餘二帰内 类成分中的许多化合物都具有较高的毒性和较严重的副作用，从而制约了此类制剂的使用 (D.Wang,F.Qi,W.Tang,F.Wang,ChemicalConstituentsandBioactivitiesoftheSkin ofBufobufogargarizansCantor,Qiem.Biodivers. ,8(2011)559-567.)。并对使用者带 来一定的安全隐患。从天然产物(赡餘皮、赡酥）中分离纯化是获得赡餘二帰内醋单体的主 要途径。由于赡餘二帰内醋类化合物数量多、结构复杂，常规的分离纯化方法较为耗时、低 效（L.Krenn,B.Kopp,Bufadienolidesfromanimalandplantsources,Phytochemistry ，48(1998) 1-29.)。然而，由于此类化合物的本身的结构复杂性和数目的繁多，关于此类化合 物的药效理，目前的认识还是远远不够的。因此，采用较为系统的高效的方法从赡餘皮中分 离出高纯度的赡餘二帰内醋类化合进而开展相关药理毒理方面的研究是十分迫切的。
技术实现思路
本专利技术涉及一种赡餘二帰内醋类化合物选择性分离纯化方法。 基于低抑值条件下，氨基酸修饰的赡餘二帰内醋类化合物和非氨基酸修饰的 赡餘二帰内醋类化合物的离子性质的不同，我们采用带正电荷的X化argeC18柱发展了 一种新型的高选择性的高效液相色谱法。流动相组成为己膳、甲醇、己醇、甲酸、己酸、H 氣己酸、水，无缓冲盐添加，便于样品制备后处理。其中所述的带正电荷的柱子为混合模 式柱（X化argeC18,北京华谱新创科技有限公司）。色谱操作参数如下；色谱柱内径为 4. 6-lOOmm;样品浓度为lmg/mL-1-lg/mL;进样量为1y心40血；流速为1-480血/min;柱温 为10-6(TC。所述流动相组成为己膳-酸-水、甲醇-酸-水、己醇-酸-水；其中酸可W 是W下酸中的一种或几种：甲酸、己酸、丙酸、H氣己酸。在该纯化体系中从赡餘皮提取物中 制备获得两组八个赡餘二帰内醋化合物。所述化合物的结构信息见式1、表1。[0(in引 式1氨基酸修饰的赡餘二帰内醋（1-4)和非氨基酸修饰的赡餘二帰内醋（5-8)的 结构式 表1纯化制得的8个赡餘二帰内醋类化合物信息[000引【主权项】1. 一种蟾蜍二烯内酯类化合物选择性分离的纯化方法，其特征在于： 1) 蟾蜍皮乙醇提取物先经制备型RPLC分离，水（A)和甲醇（B)流动相体系；洗脱梯度 为体积浓度25% - 100%B(V/V);按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，每个组分浓缩至 干后备用； 2) 针对富含蟾蜍二烯内酯的组分F13,分离过程中F13组分对应的流动相中甲醇的体 积浓度为57%-58. 3%，采用半制备反相色谱进行进纯化制备，色谱柱为XChargeC18柱；采 用乙腈-酸水溶液、甲醇-酸水溶液或乙醇-酸水溶液流动相体系，对F13进行选择性地分 离和化合物制备。2. 按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：反相色谱柱为极性 共聚的带正电荷的混合模式柱（XChargeC18);采用线性梯度、台阶梯度或等度洗脱方式， 对氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物进行选 择性分离和纯化。3. 按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：色谱操作参数如下： 色谱柱内径为4. 6-100mm ;采用体积浓度65%-80%甲醇-水溶解，蟾蜍皮95%乙醇提取物上 样浓度为 lmg/mL-i-lg/mL ;进样量为 I ii L-40mL ;流速为 l-480mL/min ;柱温为 10-60°C。4. 按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：所述流动相中酸可 以是以下酸中的一种或二种以上：甲酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸，无缓冲盐添加，便于样品制 备后处理，所述酸水溶液中酸的体积浓度为0.l%-〇. 5% (V/V)。5. 按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：所述蟾蜍皮提取物 为50%-95% (V/V)乙醇回流提取物。6. 按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于： 1) 蟾蜍皮50%-95% (V/V)乙醇提取物先经制备型RPLC分离，色谱条件：色谱 柱为碳十八柱（C18TDE柱）；水（A)和甲醇（B)流动相体系；洗脱梯度为0-7min， 体积浓度25% - 40%B; 7-60min,体积浓度40% - 65%B; 60-65min,体积浓度 65% - 100%B;65-75min, 100%B;流速为330mL/min;检测波长为300nm;其采用体积浓度 65%-80%甲醇-水溶解，样品溶液浓度为440mg/mL;进样体积为40mL;按各色谱峰的保留时 间分别收集各馏分，共计22个组分，每个组分浓缩至干后备用；针对F13(分离过程中F13组 分对应的流动相中甲醇的体积浓度为57%-58. 3%)，采用半制备反相色谱进行进纯化制备， 色谱柱为XChargeC18柱；采用乙腈-酸水流动相体系，采用线性梯度洗脱方式制备蟾蜍二 烯内酯单体化合物； 2) 选取组分F13采用半制备反相色谱进行进一步分离，色谱条件：色谱柱为带正电荷 的混合模式色谱柱（XChargeC18, 250X20mm，i.d.，5iim);体积浓度0. 1%甲酸水（A)和乙 腈（B)流动相体系；流速为19mL/min;检测波长为300nm;进样量为2mL;按各色谱峰的保 留时间分别收集各馏分，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得1，2, 3, 4, 5, 6, 7, 8八个化合 物； 通过反相色谱制备获得两类八个高纯度蟾蜍二烯内酯化合物；所述两类本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蟾蜍二烯内酯类化合物选择性分离的纯化方法，其特征在于：1）蟾蜍皮乙醇提取物先经制备型RPLC分离，水（A）和甲醇（B）流动相体系；洗脱梯度为体积浓度25%→100%B（V/V）；按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，每个组分浓缩至干后备用；2）针对富含蟾蜍二烯内酯的组分F13，分离过程中F13组分对应的流动相中甲醇的体积浓度为57%‑58.3%，采用半制备反相色谱进行进纯化制备，色谱柱为XCharge C18柱；采用乙腈‑酸水溶液、甲醇‑酸水溶液或乙醇‑酸水溶液流动相体系，对F13进行选择性地分离和化合物制备。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓龙，梁鑫淼，刘艳芳，张云，张秀莉，薛兴亚，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21