诊断人SHOX2基因和人RASSF1A基因甲基化的方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及诊断人SHOX2基因和人RASSF1A基因甲基化的方法和试剂盒。首次揭示一种通过协同检测两种肺癌标志物的甲基化DNA来诊断肺癌、提高肺癌检出率的方法，所述的肺癌标志物是人SHOX2基因和人RASSF1A基因。本发明专利技术还提供了优化的检测SHOX2基因和人RASSF1A基因甲基化DNA的试剂、检测方法。

【技术实现步骤摘要】
诊断人SHOX2基因和人RASSF1A基因甲基化的方法和试剂盒
本专利技术属于基因诊断领域，更具体地，本专利技术涉及一种诊断人SHOX2基因和人RASSF1A基因甲基化的方法和试剂盒。
技术介绍
肺癌已经成为人类癌症死亡的主要原因之一。在中国肺癌是发病率最高的癌症，且发病率和死亡率迅速增长。肺癌的发生率和死亡率是所有肿瘤中最高的，但是肺癌却不是诊断的最多的肿瘤，在美国，乳腺肿瘤和前列腺肿瘤有更高的诊断率，原因是可以早期诊断从而可以早期治疗，大大提高了5年生存率(分别为89和99％)，而肺癌的5年生存率才15％。在临床实践中，肺癌早期诊断一直是难点，癌症的早期发现对癌症患者的有效治疗是非常重要的。目前对癌症的诊断主要依据临床症状、影像学检测和组织病理学检查等，但有许多癌症临床症状出现较晚，并且活体取样检测也困难，严重影响了癌症的早期诊断和病人的预后。相对于组织活检，肺泡灌洗液、血浆、痰液等标本容易获得，对受检者也没有创伤。目前，在外周循环血中，同一基因异常甲基化的DNA只占全部DNA的极小部分，大约0.1％～1％，这些非甲基化DNA与甲基化DNA只存在微小的差异，需要从高度复杂的“背景”中检测出异常的甲基化DNA。另外循环血中的DNA通常都已经降解(通常为几十到一百多碱基对)的片段，所以需要特别的抽提和检测技术才能获得较高的灵敏度。随着技术上的快速发展，肿瘤标志物发展成为继影像诊断、病理诊断之后的肿瘤诊断治疗新的领域，对肿瘤的诊断、监测和治疗产生了重大影响。肿瘤标志物可以在体液或组织中检测到，能够反映肿瘤的存在、分化程度、预后估计和判断治疗效果等。早期肺癌由于常无特殊症状而几乎不被医生和患者察觉，用常规的诊断方法也难以早期发现和早期定性诊断，加之一些肿瘤标记物仅能作为肺癌的初筛或辅助诊断提示而不能确诊，因此肺癌的早期诊断较为困难。目前，随着基因诊断技术不断发展，给肺癌的早期诊断带来了希望，其中一个领域就是甲基化DNA检测。DNA甲基化几乎在所有肿瘤中都有发生，使其成为肿瘤诊断的一个可靠靶标。DNA甲基化是肿瘤发生的一个早期事件，在疾病确诊前就能被检测出来，是肿瘤早期诊断、患病风险预测、临床病程监控和疗效评估的潜在指标。DNA甲基化作为一种新型分子标志，在肿瘤诊断中的重要性日益受到重视，其优势主要为：其一，在肿瘤形成过程中，启动子超甲基化的发生频率很高，甚至高于基因突变，其中不乏与肿瘤形成有关的重要基因；其二，甲基化是肿瘤发生早期的重要事件；其三，DNA甲基化稳定存在，可通过PCR放大效应进行检测。因此，甲基化检测对肿瘤早期诊断有潜在的应用价值。近来国内外研究发现血浆中一些基因的甲基化DNA的含量水平用做早期诊断，敏感性要好于已有的蛋白质血清标志物，其中比较突出的有与早期肺癌相关的cyclin-dependentkinaseinhibitor2Agenep16(p16)，H-cadherin(CDH13)等基因。吸烟是肺癌的最主要原因，在正常吸烟人群的呼吸道中发现了几种在人类肺癌中经常出现的基因异常。其中，研究较多的是p16基因异常甲基化。对正常吸烟人群痰标本中的脱落细胞进行检测时，发现p16基因异常甲基化频率较高，而正常非吸烟人群痰标本中则没有发现该变化，说明这一基因改变可能与早期呼吸道肿瘤发生过程密切相关。痰液中相关基因启动子甲基化程度随着肿瘤危险性增高而增高，而CDKN2A/p16和/或MGMT基因在明确肺鳞癌诊断的3年前已可以在痰中检出。目前，有很多研究检测血液、痰液、肺泡灌洗液中的细胞或DNA甲基化状态，以期找到用于肺癌早期诊断的标志物。尽管现有技术中已经发现了一些基因的DNA甲基化与肺癌的相关性，但是目前本领域中仍然需要进一步地研究能够切实地应用于肺癌诊断的相关基因，以及开发出具有较高的检测准确性的检测试剂。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种诊断人SHOX2基因和人RASSF1A基因甲基化的方法和试剂盒。在本专利技术的第一方面，提供一种用于检测肺癌的试剂盒，所述的试剂盒中包括：特异性检测人SHOX2基因的DNA甲基化的检测试剂；和特异性检测人RASSF1A基因的DNA甲基化的检测试剂。在一个优选例中，所述的DNA甲基化序列含有CpG二核苷酸结构，并且CpG二核苷酸结构的C碱基带有甲基基团。在另一优选例中，试剂盒中，所述的特异性检测人SHOX2基因的DNA甲基化的检测试剂是针对人SHOX2基因的引物和探针；较佳地，所述的引物和探针针对人SHOX2基因中SEQIDNO:3经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列(SEQIDNO:4)；或所述的特异性检测人RASSF1A基因的DNA甲基化的检测试剂是针对人RASSF1A基因的引物和探针；较佳地，所述的引物和探针针对人RASSF1A基因中SEQIDNO:1经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列(SEQIDNO:2)。在另一优选例中，试剂盒中，所述的特异性检测人SHOX2基因的DNA甲基化的检测试剂是：SEQIDNO:14和SEQIDNO:18所示的引物以及SEQIDNO:25所示的探针；或所述的特异性检测人RASSF1A基因的DNA甲基化的检测试剂是：SEQIDNO:7和SEQIDNO:10所示的引物以及SEQIDNO:22所示的探针。在另一优选例中，试剂盒中，所述的试剂盒中还包括：特异性检测内参基因的检测试剂；较佳地，所述的特异性检测内参基因的检测试剂是针对人β-actin基因的引物和探针；更佳地，所述的引物和探针针对人β-actin基因中SEQIDNO:5经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列(SEQIDNO:6)；更佳地，所述的特异性检测内参基因的DNA甲基化的检测试剂是：SEQIDNO:19和SEQIDNO:21所示的引物以及SEQIDNO:26所示的探针。在另一优选例中，所述的内参基因用于指示DNA提取和修饰的质量。在另一优选例中，试剂盒中，针对每一基因的探针连接有特定的荧光基团；较佳地，针对人SHOX2基因的探针标记VIC荧光素，针对人RASSF1A基因的探针标记FAM荧光素，针对人β-actin基因的探针标记CY5荧光素。在另一优选例中，该试剂盒中，针对人SHOX2基因的引物和探针的比例(引物:探针)为：0.2：0.06(例如，在试剂盒中设计PCR扩增体系引物终浓度:探针终浓度＝0.2uM：0.06uM)；或该试剂盒中，针对人RASSF1A基因的引物和探针的比例(引物:探针)为：0.2：0.06(例如，在试剂盒中设计PCR扩增体系引物终浓度:探针终浓度＝0.2uM：0.06uM)；或该试剂盒中，针对人β-actin基因的引物和探针的比例(引物:探针)为：0.67：0.02(例如，在试剂盒中设计PCR扩增体系引物终浓度:探针终浓度＝0.67uM：0.02uM)。在另一优选例中，该试剂盒中，还包括(但不限于)：DNA聚合酶(如Taq酶)、dNTPs、Mg2+离子或包含DNA聚合酶(如Taq酶)、dNTPs、Mg2+离子的PCR体系；较佳地，所述的包含DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+离子的PCR体系中，所述的Mg2+离子浓度为3.5±0.5mM(较佳地3.5±0.3mM)；或所述的dNTPs浓度为0.25±0.3mM(较佳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测肺癌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括：特异性检测人SHOX2基因的DNA甲基化的检测试剂；和特异性检测人RASSF1A基因的DNA甲基化的检测试剂。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测肺癌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括：特异性检测人SHOX2基因的DNA甲基化的检测试剂，其是：SEQIDNO:14和SEQIDNO:18所示的引物以及SEQIDNO:25所示的探针；和特异性检测人RASSF1A基因的DNA甲基化的检测试剂，其是：SEQIDNO:7和SEQIDNO:10所示的引物以及SEQIDNO:22所示的探针。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：特异性检测内参基因的检测试剂，其是针对人β-actin基因的引物和探针。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物和探针针对人β-actin基因中SEQIDNO:5经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性检测内参基因的DNA甲基化的检测试剂是：SEQIDNO:19和SEQIDNO:21所示的引物以及SEQIDNO:26所示的探针。5.如权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于，针对每一基因的探针连接有特定的荧光基团。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，针对人SHOX2基因的探针标记VIC荧光素，针对人RASSF1A基因的探针标记FAM荧光素，针对人β-actin基因的探针标记CY5荧光素。7.如权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中，针对人SHOX2基因的引物和探针的比例为：0.2：0.06；或该试剂盒中，针对人RASSF1A基因的引物和探针的比例为：0.2：0.06；或该试剂盒中，针对人β-a...

【专利技术属性】
技术研发人员：王方金，陈静文，姚见儿，
申请(专利权)人：上海透景生命科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31