一种基于蝴蝶兰种子萌发的原球茎为受体的育种方法技术

本发明专利技术属于基因工程育种技术领域，具体涉及一种基于蝴蝶兰种子萌发的原球茎为受体的育种方法。该方法包括获得原球茎、增殖培养、预培养、农杆菌浸染、共培养、农杆菌洗脱、筛选培养、成芽小苗、生根等步骤。本发明专利技术以蝴蝶兰种子萌发的原球茎为受体材料构建了一套蝴蝶兰转基因受体体系，同时建立了一套基于农杆菌浸染的遗传转化体系及相应的检测体系，具有获得受体材料快捷、性能稳定、来源广泛等优点，尤其是对选择性抗生素敏感性较好，可有效回避蝴蝶兰在诱导类原球茎过程中对抗生素不敏感的问题，利于抗性转基因材料的筛选，获得较好、较纯的新的蝴蝶兰体系，对于促进蝴蝶兰新品种开发具有较好的推广应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种基于蝴蝶兰种子萌发的原球茎为受体的育种方法
本专利技术属于基因工程育种
，具体涉及一种基于蝴蝶兰种子萌发的原球茎为受体的育种方法。
技术介绍
蝴蝶兰（Phalaenopsisaphrodite）属于兰科蝴蝶兰属植物，是一种重要的盆栽花卉，具有很高的观赏价值及经济价值，但是由于在自然界中蝴蝶兰缺乏具有蓝色或香味的品种，传统的杂交育种手段不能实现对蝴蝶兰花色、花香的多样化需求。因而新的转基因育种技术在培育蝴蝶兰新品种方面得到了一定程度的应用。现有的常用转基因育种技术包括：外源基因间接转化的农杆菌介导法、外源基因直接转化的基因枪法、显微注射法和PEG介导转化法等，以及适用于多胚珠植物的花粉管通道法；其中农杆菌介导法是目前研究较多、理论机理较清楚、技术方法也较为成熟的基因转化方法。转基因育种方法虽然具有育种目的明确、育种时间较短等优点，但是在植物转基因过程中，受体材料的选择则是育种成功与否的基础与关键因素。适宜的受体材料有助于加快与完善遗传转化的顺利进行及转基因植物的成功培育。针对蝴蝶兰的转基因育种，理论而言，体细胞胚、类原球茎及原球茎都可以作为蝴蝶兰理想的遗传转化受体材料，但是当前获得体细胞胚、类原球茎的方式主要通过茎尖、茎段、叶片、根尖、根段、花梗腋芽等外植体的诱导获得，而在诱导过程中，常存在褐变，诱导率低等问题，因而蝴蝶兰转基因育种实践中，以体细胞胚或类原球茎作为受体材料常有一定的限制。另外，在以体细胞胚或类原球茎作为受体材料进行转基因育种时，采用基因枪或农杆菌浸染进行转基因操作时，也存在转染率低的缺陷，而且在农杆菌浸染操作过程中，还存在对抗生素敏感性低等弊端，因而急需进一步改进。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种基于蝴蝶兰种子萌发的原球茎为受体的育种方法，该方法以蝴蝶兰种子萌发的原球茎为转基因育种受体材料，可以较好的克服现有的以外植体诱导获得受体材料存在的褐化、转化率低、品质差异、诱导时间长、生长速度慢、继代困难等弊端；同时本专利技术以蝴蝶兰“红龙”和“光芒四射”品种为例，培育了新的蝴蝶兰品种，该品种培育过程中以农杆菌浸染方式进行转基因操作，分别导入花色、花香两种基因成分，为培育获得新的蝴蝶兰种质资源提供了新的参考和借鉴。本专利技术的技术方案详细介绍如下。一种基于蝴蝶兰种子萌发的原球茎为受体的育种方法，包括以下步骤：（1）无菌条件下，将蝴蝶兰种子在种子诱导萌发培养基中萌发生长，获得原球茎；所述蝴蝶兰品种优选为“红龙”或“光芒四射”；所述种子诱导萌发培养基为：3g/L花宝1号+2g/L活性炭+2g/L水解酪蛋白+15g/L蔗糖+2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+6.5g/L琼脂，pH=5.5~5.6；培养条件为：日温25℃、夜温17℃，光强3000Lx，日光照16h，培养60~90d；（2）将步骤（1）中原球茎切块后直接或者增殖培养后作为受体材料；增殖培养基为：3g/L花宝1号+2g/L活性炭+15g/L蔗糖+3mg/L6-BA+0.6mg/L2,4-D+6.5g/L琼脂，pH=5.5~5.6；培养条件为：日温25℃、夜温17℃，光强3000Lx，日光照16h，增殖培养60~90d，增殖培养至直径大小约为0.5cm左右的原球茎可作为转基因的受体材料；步骤（1）中原球茎切块直径最小不应小于0.3cm；（3）将步骤（2）中增殖培养的受体材料预培养3d，进行农杆菌浸染；所述预培养所用培养基及生长条件同步骤（2）；所述农杆菌浸染液为重悬液，重悬液采用液体增殖培养基，配方为：3g/L花宝1号+15g/L蔗糖+3mg/L6-BA+0.6mg/L2,4-D，pH=5.5~5.6；农杆菌浸染时，重悬液OD600=0.4~0.6，浸染15min；所述农杆菌浸染液中菌株为重组农杆菌菌株GV3101，该菌株包含有质粒表达载体pCAMBIA1301-RcOOMT2、pCAMBIA1303-VwF3’5’H；所述质粒表达载体pCAMBIA1301-RcOOMT2、pCAMBIA1303-VwF3’5’H是通过对pCAMBIA1301、pCAMBIA1303载体进行改造获得，具体步骤为：首先分别在pCAMBIA1301、pCAMBIA1303载体的多克隆位点处加上CAMV35S启动子（pCAMV35S）和CAMV35S终止子（T-CAMV35S）；然后在载体的基因组中分别重组整合月季花香基因RcOOMT2、三色堇蓝色基因VwF3’5’H；最后将改造完成的质粒表达载体pCAMBIA1301-RcOOMT2、pCAMBIA1303-VwF3’5’H转化至农杆菌菌株GV3101即可；（4）将步骤（3）浸染后受体材料置于共培养培养基上，25℃条件下暗培养3d；所述共培养培养基组分同步骤（2）中增殖培养基；（5）将步骤（4）中共培养后的受体材料进行农杆菌洗脱，洗脱采用含有300mg/LCef无菌水浸泡20~30min进行；（6）将步骤（5）中洗脱后的受体材料置于筛选培养基上，筛选培养过程中，每15d进行一次转筛，每次转筛前均需要按照步骤（5）中方法进行农杆菌的洗脱；所述筛选培养基为：步骤（2）中增殖培养基+8mg/LHyg+50mg/LCef，pH=5.5~5.6；培养条件为：日温25℃、夜温17℃，光强3000Lx，日光照16h；筛选培养四轮后，接入步骤（2）的增殖培养基+50mg/LCef的培养基中，继续培养直至分化成芽并长成小苗；筛选鉴定；培养条件为：日温25℃、夜温17℃，光强3000Lx，日光照16h；（7）将步骤（6）中筛选鉴定正确的蝴蝶兰植株进一步扩增或者接入生根培养基诱导生根；所述生根培养基为：3g/L花宝1号+1.5mg/LIBA+20g/L蔗糖+1g/L活性炭+6.5g/L琼脂，pH=5.5~5.6。本专利技术以蝴蝶兰种子萌发的原球茎为受体材料构建了一套蝴蝶兰转基因受体体系，同时建立了一套基于农杆菌浸染的遗传转化体系及相应的检测体系，相较于现有的蝴蝶兰转化体系，较为明显的技术优势体现在如下几个方面：一是，利用种子萌发的原球茎所构建的受体体系，相较于其他通过外植体获得受体材料方式更加快捷；同时本专利技术也提供了原球茎的扩增体系，因而总体而言，本专利技术的受体材料相较于现有技术，受体材料性能稳定，来源广泛；二是本专利技术所构建的遗传转化体系对选择性抗生素敏感性较好，可有效回避蝴蝶兰在诱导类原球茎过程中对抗生素不敏感的问题，利于抗性转基因材料的筛选。总体而言，本专利技术通过对现有蝴蝶兰原球茎繁殖体系的筛选、优化，对现有的蝴蝶兰转基因育种体系的改良应用，成功构建了一套较为完整的和转化、筛选效果较好的蝴蝶兰转基因育种体系，技术手段较为成熟、育种效果具有较好的保障，对于促进蝴蝶兰新品种开发具有较好的推广应用价值。附图说明图1为pCAMBIA1301、pCAMBIA1303载体改造示意图；图2为pCAMBIA1301-RcOOMT2、pCAMBIA1303-VwF3’5’H质粒表达载体构建示意图；图3为蝴蝶兰组织培养中种子萌发60d所形成的原球茎；图4为不同生长调节剂组合处理对原球茎增殖培养的影响；图5为不同浓度6-BA、2,4-D组合处理对原球茎增殖培养的影响；图6为不同活性炭含量对原球茎生长的影响，其中A：0mg/L活性炭，B：1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于蝴蝶兰种子萌发的原球茎为受体的育种方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）无菌条件下，将蝴蝶兰种子在种子诱导萌发培养基中萌发生长，获得原球茎；（2）将步骤（1）所得原球茎切块后直接或者增殖培养后作为受体材料；（3）将步骤（2）所得的受体材料预培养，进行农杆菌浸染；（4）将步骤（3）浸染的受体材料置于共培养培养基上，25℃条件下暗培养3d；（5）将步骤（4）中共培养后的受体材料进行农杆菌洗脱，洗脱采用含有300mg/L Cef无菌水浸泡20~30min进行；（6）将步骤（5）洗脱后的受体材料置于筛选培养基上进行筛选培养，筛选培养过程中，每15d进行一次转筛，每次转筛前均需要按照步骤（5）中方法进行农杆菌的洗脱；筛选培养四轮后，继续培养直至分化成芽并长成小苗；筛选鉴定；（7）将步骤（6）中筛选鉴定正确的蝴蝶兰植株进一步扩增或者接入生根培养基诱导生根。

【技术特征摘要】
1.一种基于蝴蝶兰种子萌发的原球茎为受体的育种方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）无菌条件下，将蝴蝶兰种子在种子诱导萌发培养基中萌发生长，获得原球茎；（2）将步骤（1）所得原球茎切块后直接或者增殖培养后作为受体材料；（3）将步骤（2）所得的受体材料预培养，进行农杆菌浸染；（4）将步骤（3）浸染的受体材料置于共培养培养基上，25℃条件下暗培养3d；（5）将步骤（4）中共培养后的受体材料进行农杆菌洗脱，洗脱采用含有300mg/LCef无菌水浸泡20~30min进行；（6）将步骤（5）洗脱后的受体材料置于筛选培养基上进行筛选培养，筛选培养过程中，每15d进行一次转筛，每次转筛前均需要按照步骤（5）中方法进行农杆菌的洗脱；筛选培养四轮后，继续培养直至分化成芽并长成小苗；筛选鉴定；（7）将步骤（6）中筛选鉴定正确的蝴蝶兰植株进一步扩增或者接入生根培养基诱导生根；步骤（1）中所述蝴蝶兰品种为“红龙”或“光芒四射”；所述种子诱导萌发培养基组成为：3g/L花宝1号+2g/L活性炭+2g/L水解酪蛋白+15g/L蔗糖+2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+6.5g/L琼脂，pH=5.5~5.6；步骤（1）中原球茎切块直径不小于0.3cm；步骤（2）中所述增殖培养采用的为增殖培养基，增殖培养基组成为：3g/L花宝1号+2g/L活性炭+15g/L蔗糖+3mg/L6-BA+0.6mg/L2,4-D+6.5g/L琼脂，pH=5.5~5.6；步骤（4）中所述共培养培养基的组成同增殖培养基。2.如权利要求1所述基于...

【专利技术属性】
技术研发人员：张和臣，王利民，孟月娥，董晓宇，符真珠，张晶，李艳敏，王慧娟，蒋卉，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：河南;41