检测BRAF基因突变的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了检测BRAF基因突变的试剂盒及其检测方法，试剂盒含有针对BRAF基因突变位点的LNA锁核酸修饰的特异探针，该特异探针能够与野生型DNA结合，能检出含0.01％BRAF基因突变DNA的样本、最低检出限为2-5拷贝，本发明专利技术的检测方法对BRAF基因突变检测具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性等优点，特别适合从血浆，尿液，唾液等含有突变含量低的体液中检测基因突变，适合对结直肠癌进行早期筛查和诊断，为个体化用药提供指导。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及检测BRAF基因突变的试剂盒，还涉及利用该试剂盒在非疾病诊断中检测BRAF基因突变的方法。
技术介绍
BRAF基因是Ras的下游基因，属于RAF基因家族，定位于7q34，编码的BRAF蛋白由783个氨基酸组成，有CR1、CR2和CR3三个保守区域，与BRAF蛋白同为Ras-Raf-MEK-ERK信号通路中上游重要调节因子。该酶将信号从Ras转导至MEK1/2，MEK1/2再激活ERK1/2，激活的ERK可影响核因子KB、细胞周期蛋白D1，使其表达增强。其中CR1区含有Ras蛋白结合区和富含半胱氨酸区，CR3区为ATP结合位点和激活区，有多个磷酸化位点，其中T598和S601最为重要，这两个磷酸化位点同时活化后，可激活BRAF蛋白和诱导性激活ERK，而这两个位点氨基酸的改变将导致BRAF蛋白的持续激活，从而促进细胞增殖并减少细胞凋亡，使血管生成因子、表皮细胞生长因子受体表达增加，促进血管生成，可使β整合素表达增加，促进组织侵袭和迁移。BRAF基因90％的突变集中在编码部分CR3激活区的15号外显子中，这些突变位点大多为1799核苷酸T突变为A，导致谷氨酸突变为缬氨酸(V600E)。BRAF基因突变导致Raf激酶的活性大力增加并活化下游激酶Erk，MAPK通路持续激活，使前有丝分裂原有效分裂能力增强，同时抑制促凋亡因子BIM，引起细胞异常增殖分化。结直肠癌(CRC)是人类常见的恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率在我国呈逐年上升之势，患者中约15％的患者BRAF基因发生了突变。国内有实验证实，大约65％的结直肠癌与BARF基因突变有关，BARF基因突变后，产生MAPK信号通路的持续激活，导致细胞增殖和分化。免疫组化研究结果显示，BARF蛋白在结直肠癌中高度表达，阳性率达到80％，且低分化癌的表达强度明显高于高分化癌，在统计学上的表达模式符合“增生性息肉-锯齿状腺瘤-癌”递增趋势。目前，结直肠癌的治疗方式主要以手术方式为主，以化学药物治疗和放射性治疗为辅助疗法。随着生物与医学相关科学的发展，结直肠癌治疗中的分子靶向药物和靶向预测指标越来越受到重视，并逐渐将结果运用到临床治疗之中。2009年，美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)公布了已被证实的结直肠癌个体化治疗的相关药物与检测靶标，与其相关的靶向治疗药物为西妥昔单抗和帕尼单抗。西妥昔单抗是嵌合型抗体，与BRAF能够特异性结合，以阻止EGF激活受体，抑制下游信号向BRAF传递，从而干扰肿瘤生长、侵袭、迁移、细胞修复和血管生成。与帕尼单抗的区别在于，后者是完全人源化的单克隆抗体，临床中，可以在提供有效治疗的同时减少免疫应答反应，较少发生输液反应、变态反应和过敏反应。然而，随着对西妥昔单抗研究的不断深入，西妥昔单抗的使用受限于BRAF基因为野生型的患者，而且BARF基因中不能存在特殊突变，否则抗BRAF的治疗无效。因此，2010年NCCN的结直肠癌临床实践指南中，推荐在使用抗BRAF单克隆抗体进行治疗之前，要增加对BRAF基因野生型患者的BARF基因突变的检测，对于存在BARF基因中存在V600E突变的患者，不推荐使用抗BRAF单克隆抗体进行治疗。因此，BRAF基因是一个很好的早期预防及治疗结直肠癌的靶点。各种来源的结直肠癌组织是检测突变的最佳样本，但部分中晚期患者难以得到较佳的病理组织，检测血浆中来自肿瘤的DNA是否有突变是一种趋势。肿瘤患者的血浆循环DNA，亦称非细胞游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)中包含肿瘤起源的DNA，与原发肿瘤基因组DNA具有相同的遗传特征。肿瘤cfDNA包括来源于正常细胞的野生型DNA和肿瘤细胞DNA，多项研究表明肿瘤患者血浆中可以检测到与自身肿瘤相一致的DNA突变。因此，检测组织或血浆BRAF基因突变对于指导CRC病人临床用药，具有重要的参考价值。目前检测基因突变的方法主要有以下几种：(1)直接测序法。直接测序法的原理是：首先针对突变位点设计探针(每个基因设计一对探针，探针所对应的产物尽可能的包含突变位点所在的位置)，然后通过简单PCR扩增获得目的基因产物，最后对PCR产物进行测序并且对测序结果进行初步分析。初步分析完成后，对一些可能的突变样品的PCR产物，需要对目的条带进行切胶回收；回收后的PCR产物连接克隆载体；挑选阳性克隆测序并对测序结果进行分析。此过程比较繁琐、耗时长，而且由于测序方法本身的限制导致其灵敏度不高，只能对含量大于20％的基因突变进行检测。因此，此法不适合在临床中的应用与大量的临床样本分析。(2)变性高效液相色谱法(denaturing high-performance liquid chromatograph，DHPLC)。该方法的原理是基于发生错配的杂合双链DNA与完全匹配的纯合双链DNA解链特征的差异将他们分离开。由于杂合双链在突变位点处出现错配，更易于形成“Y”形结构，与固定相的结合能力降低，因此杂合DNA链要比纯合DNA链优先洗脱出来，通过洗脱峰的不同判断有无突变存在。DHPLC可检测出含有单个检测的突变、插入或者缺失的异源双链片段。该法对已知和未知的突变位点均可以检测，敏感性在5％左右，但检测过程中需要打开反应管，容易造成污染，而且阳性结果不能确认其具体未知，最终还需测序确认。(3)高分辨率溶解曲线(high resolution melting，HRM)。高分辨率溶解曲线是基于核酸的物理性质，通过饱和染料结合于PCR扩增产物，监控产物熔解曲线的变化分析基因突变。检测敏感性在5％左右，对于阳性结果并不能确定其具体位置，最终还需要通过测序加以确认。(4)探针扩增阻滞突变法(amplification refractory mutation system，ARMS)。利用PCR探针的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计针对突变位点的特异性PCR扩增探针，在严格的条件下，只有在探针3’碱基与模板配对时PCR扩增反应才能正常进行，从而检测出突变。通过设计两个5’端探针，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯和性突变，分别加入两种探针及3’端探针进行两个平行的PCR，结合有与突变DNA完全互补的探针才可以延伸并得到PCR扩增产物，该检测方法的灵敏度在1％左右。(5)等位基因特异的Taqman聚合酶链式反应(competitive allele-specific TaqMan po本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有针对BRAF基因V600E突变位点的LNA锁核酸修饰的特异探针。

【技术特征摘要】
1.检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有针对BRAF基因V600E突
变位点的LNA锁核酸修饰的特异探针。
2.根据权利要求1所述检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于：所述LNA锁核酸修饰
的特异探针的核苷酸序列为CAG+TGA+AA+TC+TC+GA+TGGAG-PO4，其中“+”后的T，
A或G表示锁核酸修饰的碱基。
3.根据权利要求1所述检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包含检
测BRAF基因突变的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括
PCR缓冲液、dNTPs、Eva Green和二氯化镁。
5.根据权利要求4所述检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中各组分的
终浓度如下：1×PCR buffer、2.5mM MgCl2、dNTP 250μM、引物250nM、探针500nM、1×EVE 
GREEN、DNA聚合酶1U和DNA模板2～20ng。
6.权利要求1～5任一项所述检测BRAF基因突变的试剂盒在非疾病诊断中检测BRAF基因
突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.设计检测BRAF基因突变的引物和针对BRAF基因突变位...

【专利技术属性】
技术研发人员：王弢，李宗飞，孙爱娟，李杰，张丽，
申请(专利权)人：苏州工业园区为真生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32