抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C-scFv及其应用制造技术

本发明专利技术提供了抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C-scFv，它是利用人工合成的重组蛋白BontB，及筛选抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C-scFv的底物GFP-HIS6-SNAP25（62）-VAMP（57）-C，人源化抗B型肉毒毒素酶抗体库中筛选出来的，亲和常数为（4.38±0.445）×105L/mol，为生产抗B型肉毒毒素特效救治药物及快速检测B型肉毒毒素奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物
，具体涉及抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C-scFv，及其应用，在生产治疗B型肉毒毒素酶中毒药物方面、检测B型肉毒毒素酶方面的应用。
技术介绍
肉毒毒素可导致人及动物肉毒中毒，其感染剂量极低，从灵长类动物实验中得出，最低致死剂量（LD50）为1ng/kg，因此，它已被美国疾病控制和预防中心指定为对人类的威胁类似于炭疽的生物武器。导致肉毒中毒的原因大致分为四个类型，一、成人肉毒中毒。二、婴儿感染性肉毒中毒。三、伤口感染性肉毒中毒。肉毒毒素是肉毒梭菌在自然状态下或者是在培养基中形成，通过细菌裂解释放到环境或培养液中，这种形态的毒素被称为前体毒素，其分子量范围在300 kDa到900 kDa。前体毒素通常以复合体的形式存在，由神经毒素（Bont），由一个或多个能够包围和保护毒素的非毒性蛋白组成，包括血凝素（HA）,非毒素非血凝素（NTNH）。临床上所说的肉毒毒素通常指具有神经毒性作用的神经毒素部分。肉毒毒素根据其抗原性的不同，共存在七种血清型（A、B、C、D、E、F、G、），尽管七种血清型的肉毒毒素组成成分与它的作用机制略有差别，但是它们有着相近的分子量和相似结构。成熟肉毒毒素均由约150 kDa的单链多肽组成，蛋白质成熟时通过细菌介导的蛋白酶将150kDa的单链多肽切割裂解成两个不相等的多肽片段，两个片段由一个二硫键连接，形成一个分子量为50kDa的轻链片段（LC）和一个分子量为100kDa的重链片段（HC）。其中轻链有一个催化功能域，重链包含分子量均为50kDa的两个功能域， N端部分为跨膜域，C端部分为神经节苷脂结合域。单独的轻链和重链均无毒性，只有双链才具有生物学毒性。轻链由细胞内毒素蛋白组成，具有锌离子依赖内切酶活性，可抑制神经递质的释放。肉毒毒素的活性区埋藏（~20 ?深）于轻链中，表面负电荷，可通过一个通道获得。梭状神经毒素的活性位点包括一个单一的锌原子，这个锌原子历来被认为有功能，但是不起结构性作用。可以通过用金属螯合剂去除锌，但是通过在二级结构上加入游离的锌原子来重新获得锌，毒素与底物结合的能力几乎不变，但轻链的生物学活性却大大的降低了，只相当于原来的30%。位于轻链中心有一个高度保守的锌结合模块HExxH （X是任意的氨基酸）序列。HExxH 序列中含有一个由3个组氨酸整合的锌离子，并对突触泡膜蛋白质具有特异性蛋白水解活性，这个催化位点位于蛋白质表面较深的裂缝中。在人类肉毒中毒中，A型肉毒毒素和B型肉毒毒素占据最重要的地位，其中A型肉毒毒素轻链上的His 222, Glu223 和His226残基共同组成了锌结合模块HExxH 序列的一部分，并且在协调活性区锌（His 222 和His226）和一个水分子（Glu223残基）的作用机制中起了直接的作用。Glu261 是协调锌的第三配体。甚至有人认为A型肉毒毒素的催化机理与嗜热菌蛋白酶是相似的，这是因为基于结构和序列相似的基础上，他们的活性位点也是相似的。从Glu223到 Asp的突变使得活性几乎全部失去，去除His226使A型肉毒毒素失去了催化活性。通过对肉毒毒素结构分析表明，A 、B型肉毒毒素中与作用机制相关的关键氨基酸残基是相同的。与突触泡蛋白结合的B型肉毒毒素的晶体结构表明，Arg369 和 Tyr372残基位于接近被毒素裂解的肽键。肉毒毒素中中和残基的突变使催化速度常数明显降低，但是不影响锌结合和底物结合，人们提出，这些残基在过渡态稳定中发挥了作用。另外，在LC活性中心还有一些氨基酸残基，如Phe266、Glu350Arg363和Tyr366。它们的功能主要是维持和稳定轻链活性中心的结构和/或它与被结合底物的相对位置，以此保证轻链最佳的酶解能力。LC通过二硫键与HC的N端连接。在二硫键存在的状态下，毒素重链HN结构域形成一条loop结构，将深陷于轻链表面裂缝中的Zn2+催化部位遮蔽住，从而不表现酶活性。在双链毒素进入神经细胞后，二硫键被还原，释放出的轻链才能表现锌离子内肽酶活性，催化部位能够容纳底物16个氨基酸残基。催化部位的锌离子除同4个组氨酸残基的咪唑环、1个结合于保守谷氨酸的水分子形成配位键外，还与另一分子的谷氨酸羧基形成配位键，1个色氨酸分子很可能也参与锌离子的配位。毒素轻链的这种独特锌离子配位形式、空间结构与其他所有已知的金属蛋白酶的三维结构都不同，应当属于一个新型的金属蛋白酶家族。肉毒毒素的致病机理1、靶细胞的识别与结合    前体毒素进入胃肠道，在消化过程中，非毒素组分对神经毒素起到保护作用，使其不会受到各种消化酶和胃酸的侵蚀。由于分子量过大，毒素分子不是以扩散的方式，而是以“内凹”和细胞摄入的方式通过肠粘膜上皮屏障，而不会破坏胃肠道。然后进入小肠中，在小肠的微碱性环境下，前提毒素中的神经毒素解离出来，进入血液及淋巴循环，在运动神经和交感神经处发挥其毒性作用。尽管神经毒素可侵入不同的组织和器官,但不能穿透血脑屏障,其惟一的亲和靶点是外周胆碱能神经末梢。在胆碱能神经末梢，毒素的轻链能够抑制神经递质乙酰胆碱在神经肌肉接头处的释放，导致肌肉麻痹。在这一毒性作用过程中，神经毒素的各功能域都有参与，具体的过程可分为三个阶段。靶细胞的结合与内化     在靶细胞的识别与结合这一过程中，肉毒毒素重链的结合域发挥了作用。结合域能够识别胆碱能神经末梢，并与其发生特异性结合。结合域结合到运动神经元的神经节苷脂和位于末端神经细胞膜表面小结上的蛋白受体，特别是具有亲和力的GD1b, GT1b 和GQ1b类神经节苷脂。然后由含有唾液酸的寡糖组成的神经节苷脂连接到神经酰胺。通过对神经节苷脂分布及对其亲和结合力的研究，可以确定，神经节苷脂不是唯一能促进肉毒毒素结合的分子，而双受体模型的提出表明，在发生内化作用前，肉毒毒素就已经结合到了蛋白受体上。尽管有一些证据表明，突触结合蛋白可能参与了A、B和E型的内化作用，但是梭菌属家族每一个成员的受体，还没有完全确定。每个毒素与其蛋白共受体都是特异性同源的，B型肉毒毒素与唾液酸乳糖的混合物就与肉毒毒素蛋白部分相似，表明了神经毒素与神经节苷脂结合的一个\锁和钥匙\原理。这个观察成功说明了一个观点，那就是神经节苷脂结合使肉毒毒素靠近蛋白受体，促进了毒素的识别和内化。一旦结合到神经元表面，母体分子裂解，重链和轻链通过锌原子结合到达神经元细胞膜，并且被内化进入细胞囊泡，形成一个包裹着毒素分子的酸性小囊泡。即内化过程。这一受体介导的内吞过程与时间，温度及突触活动均有关。2、易位肉毒毒素的轻链必须从囊泡小室或者胞内体中出来，并且在H链N-末端作用下的通过膜运输能够成功进入细胞溶质的靶蛋白，这一过程是称为轻链易位。与其它梭菌毒素一样，肉毒毒素进入细胞内的酸性小泡后，会因pH的变化而发生结构重组。尽管进入突触小泡和胞内小泡是显而易见，但是肉毒毒素易位进入胞内小泡的特性尚未断然确定。pH的降低使肉毒毒素结构发生变化，从而导致其在分子中有较大的疏水性，并且增加了脂双层的渗透性。这样毒素的重链和轻链能够嵌入小泡的脂双层内，一旦嵌入，就会在本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C‑scFv，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.9所示。

【技术特征摘要】
1.抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C-scFv，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.9所示。
2.抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C-scFv，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示。
3.权利要求1所述的抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C-scFv在生产治疗B型肉毒毒素酶中毒药物方面的应用。

【专利技术属性】
技术研发人员：张国利，田园，刘雪，于佳，李玉洁，刘雨玲，岳玉环，吴广谋，李爽，史飞，赵鑫，徐艳玲，张培培，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所，
类型：发明
国别省市：吉林;22