【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】政府利益本专利技术在国立卫生研究院授予的批准号1U01 AI082184下由政府支持完成。政府对本专利技术具有一定的权利。相关申请的交叉引用本申请要求2012年9月10日提交的标题为“多重扩增循环检测”的美国临时专利申请号61/699,103的权益和优先权，其整体通过引用结合到本文中。专利技术背景在美国、加拿大和西欧，传染病占人类死亡率的约7%，而在发展中地区，传染病占人类死亡率的超过40%。传染病导致多种临床表现。常见的明显表现为发烧、肺炎、脑膜炎、腹泻和含血腹泻。尽管身体表现提示一些病原体为病原并排除其它，仍剩余多种可能的病原体，清楚的诊断常常需要进行多个测定。用于诊断病原体的传统微生物学技术可耗费数日或数周，常常延误适当的疗程。近年来，聚合酶链反应(PCR)已经成为快速诊断传染原的方法选择。PCR可为诊断传染病的快速、灵敏和特异工具。使用PCR作为主要诊断方法的挑战为可能致病微生物的多样性和一些病理标本中所存在的生物的水平低。运行大量PCR测定板(针对每种可能的致病微生物为一个，其中多数预期为阴性)常常是不实际的。当病原体核酸处于低浓度以及需要大量样品以收集足够的反应模板时该问题恶化。在一些情况下，样品不足以测定所有可能的病原。一种解决方案为运行“多重PCR”，其中样品在单个反应中同时测定多个靶标。尽管已经证明多重PCR在一些系统中有价值，但关于高水平多重反应的健壮性和难以清楚分析多个产物存在缺陷。为了解决这些问题，可随后将测定分为多个二级PCR。将二级反应嵌套在初级产物内常常增加健壮性。然而，此进一步的...
【技术保护点】
用于鉴定样品中含有多种生物中的哪些的方法，包括提供多个样品孔，每个样品孔含有部分样品和用于扩增来自多种生物中的不同生物的靶核酸序列的引物，同时使多个样品孔经受扩增条件，经历若干扩增循环，检测第一组多个样品孔的每个中是否发生扩增，同时使多个样品孔经受扩增条件，经历若干额外的扩增循环，检测第二组多个样品孔的每个中是否发生扩增，通过鉴定至少一个发生扩增的对应样品孔鉴定样品中存在的至少一种生物。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.09.10 US 61/6991031.用于鉴定样品中含有多种生物中的哪些的方法，包括
提供多个样品孔，每个样品孔含有部分样品和用于扩增来自多种生物中的不同生物的靶核酸序列的引物，
同时使多个样品孔经受扩增条件，经历若干扩增循环，
检测第一组多个样品孔的每个中是否发生扩增，
同时使多个样品孔经受扩增条件，经历若干额外的扩增循环，
检测第二组多个样品孔的每个中是否发生扩增，
通过鉴定至少一个发生扩增的对应样品孔鉴定样品中存在的至少一种生物。
2.权利要求1的方法，其中第一个检测步骤不涉及检测第二组多个样品孔中是否发生扩增，第二个检测步骤不涉及检测第一组多个样品孔中是否发生扩增。
3.权利要求2的方法，其中第一组第一个样品孔的阳性或阴性判定决定第二个样品孔是在第一组还是在第二组中。
4.权利要求1的方法，进一步包括
同时使多个样品孔经受扩增条件，经历另一个若干额外扩增循环，
检测第三组多个样品孔的每个中是否发生扩增。
5.权利要求4的方法，其中扩增循环的数目为20个PCR循环，额外扩增循环的数目为6个额外的PCR循环，另一个额外扩增循环的数目为6个额外的PCR循环。
6.权利要求4的方法，进一步包括至少一个额外的同时使多个样品孔经受扩增条件经历又一个若干额外扩增循环的步骤和至少一个额外的检测步骤。
7.权利要求4的方法，其中第一组多个样品孔配置为扩增来自以最高滴度存在的生物的靶核酸序列并具有最高的不期望阳性的风险，第二组多个样品孔配置为扩增来自以高滴度存在的生物的靶核酸序列并具有中等的不期望阳性的风险，第三组多个样品孔配置为扩增来自以低滴度存在的生物的靶核酸序列并具有低的不期望阳性的风险。
8.权利要求1的方法，其中所述检测步骤包括使多个样品孔经受熔解条件和检测靶核酸序列是否发生熔解。
9.权利要求8的方法，其中检测是否发生熔解包括检测多个样品孔的每个在预定温度范围内的熔解峰。
10.权利要求1的方法，其中检测步骤包括分析每个样品孔的扩增曲线。
11.权利要求10的方法，其中分析扩增曲线包括测定交叉点。
12.权利要求1的方法，进一步包括在提供步骤前使样品经受多重扩增。
13.权利要求12的方法，其中所有步骤在单独的封闭系统中进行。
14.权利要求1的方法，其中所有检测步骤包括检测多个样品孔的任一中是否发生扩增。
15.权利要求1的方法，其中第一个检测步骤中的阳性判定指示染色体整合，第一个检测步骤中的阴性判定并且第二个检测步骤中的阳性判定指示临床-相关感染。
16.权利要求1的方法，其中每个样品孔进一步包含荧光染料，第一个检测步骤采用第一个水平的照明，第二个检测步骤采用第二个水平的照明。
17.权利要求16的方法，其中第二个水平比第一个水平高，并且进一步包括步骤：
同时使多个样品孔经受扩增条件，经历额外若干个额外扩增循环，
通过采用第三个水平的照明检测第二组多个样品孔的每个中是否发生扩增，第三个水平比第二个水平高。
18.用于鉴定样品中含有多个靶核酸中的哪些的方法，包括
提供多个样品孔，每个样品孔具有用于扩增来自多个靶核酸序列中不同序列的基因座的引物，
将一部分样品移至多个样品孔的每个中，
同时使多个样品孔经受扩增条件经历若干扩增循环，
检测第一组多个样品孔的每个中是否发生扩增，
同时使多个样品孔经受扩增条件，经历若干额外的扩增循环，
检测第二组多个样品孔的每个中是否发生扩增，
通过鉴定发生扩增的对应样品孔鉴定样品中存在的靶核酸。
19.权利要求18的方法，进一步包括
在单个多重扩增反应中同时扩增所有基因座，然...
【专利技术属性】
技术研发人员：RP拉斯穆森，RJ克里斯普，AC赫默特，EDB坎贝尔，TC罗宾斯，DJ艾尔，
申请(专利权)人：拜奥法尔诊断有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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